pLenti6/V5-DEST-TAZ载体的构建及其对成骨前体细胞MC3T3-E1分化的影响

目的:构建人真核表达的TAZ慢病毒载体pLenti6/V5-DEST-TAZ,转染293FT细胞获得重组慢病毒颗粒,探讨TAZ对成骨前体细胞MC3T3-E1分化的调控作用。方法:将已经过测序验证的含有TAZ基因慢病毒入门质粒pENTR(tm)221-TAZ通过LR反应克隆到慢病毒载体pLenti6/V5-DEST中。对重组质粒进行酶切鉴定,并在细胞中验证表达。将该重组载体和其他PackingMix3个质粒载体充分混合,用阳离子脂质体转染293FT细胞,培养和待细胞完全裂解后收集富含TAZ基因的病毒颗粒上清液,取适量上清液感染MC3T3-E1细胞,采用杀稻瘟菌素Blastcidin筛选,建立稳定过量表达TAZ蛋白的MC3T3-E1/TAZ细胞系。用条件培养基诱导MC3T3-E1和MC3T3-E1/TAZ细胞系向成骨细胞定向分化,vonKossa和茜素红染色观察MC3T3-E1和MC3T3-E1/TAZ细胞的成骨分化。结果:凝胶电泳和测序结果均证明TAZ重组慢病毒载体pLenti6/V5-DEST-TAZ构建正确,并能在细胞中正确表达。与辅助质粒共转包装细胞获得慢病毒颗粒,并成功感染MC3T3-E1细胞。VonKossa染色和茜素红染色,MC3T3-E1/TAZ细胞系中生成的磷酸钙比MC3T3-E1细胞系中生成的磷酸钙多。结论:成功构建了人真核表达的质粒载体pLenti6/V5-DEST-TAZ,并能在细胞中正确表达;成功包装了TAZ病毒,并获得过表达TAZ的MC3T3-E1细胞;过表达TAZ促进MC3T3-E1向成骨细胞分化。

bcl-xL在姜黄素诱导K562细胞凋亡中的作用及机制

目的:探讨bcl-xL基因在姜黄素诱导K562细胞凋亡过程前后的表达情况及其作用机制。方法:不同浓度的姜黄素作用于K562细胞,MTT检测细胞生长抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot分析姜黄素作用前后胃癌细胞中bcl-xL的表达。结果:姜黄素能显著抑制体外培养的K562细胞生长并呈量效和时效关系。流式细胞术检测到亚二倍体凋亡峰,细胞凋亡率增加。RT-PCR和Western blot结果提示经姜黄素作用后,bcl-xL表达下降。结论:姜黄素能抑制K562细胞的生长并促进其凋亡,其发生与bcl-xL有关。