梅毒螺旋体膜抗原基因在毕赤酵母中的表达和蛋白纯化

以梅毒螺旋体(Treponema pallidumsubsp.pallidum)Nichols菌株基因组DNA为模板,通过PCR扩增梅毒螺旋体47kDa、17kDa和15kDa 3个膜抗原基因,克隆进毕赤酵母表达载体pPICZ B,构建重组表达载体pTP47、pTP17、pTP15,转化酵母菌株GS115,甲醇诱导表达。表达菌体裂解后通过镍离子亲和层析获得3个抗原与6xHis tag的融合蛋白,重组蛋白的获得量分别为His-TP15:4.8mg/L;His-TP 17:6.6mg/L;His-TP47:25mg/L,经SDS-PAGE鉴定纯度都在96%以上,ELISA鉴定均具有很好的抗原性。从而首次在毕赤酵母中表达出梅毒螺旋体膜抗原,为梅毒血清学检测方法开辟了新的抗原制备途径。

乙肝表面抗原在分泌型毕赤酵母中的表达及纯化

目的对分泌型毕赤酵母中表达乙肝表面抗原并进行亲和层析纯化。方法从已确诊的乙肝患者阳性血清中提取乙肝病毒DNA,PCR扩增乙肝病毒表面抗原编码基因S,将其插入含有α分泌信号肽序列和6个组氨酸纯化标签的毕赤酵母表达载体pPICZα,成功构建了重组表达载体pPICZα-HBVs。电转化酵母菌株GS115,得到重组乙肝表面抗原S的酵母表达菌株。结果诱导培养基BMMY中甲醇终浓度为1%,诱导表达48 h重组蛋白表达量及抗原性达到最高。非变性条件下亲和层析纯化后,薄层扫描分析得到纯度超过95%,表达量约为2 mg/L的重组蛋白。结论W estern-blot和ELISA分析表明,所得产物为乙肝表面抗原S蛋白,其纯度和产量足以免疫小鼠制备单克隆抗体。

猪血红蛋白及戊二醛聚合猪血红蛋白氧载体的研究

目的阐明猪血红蛋白的主要理化特性,并了解戊二醛聚合反应对猪血红蛋白主要性能的影响。方法猪血经多步纯化获取高纯度猪血红蛋白,以戊二醛为交联剂制备聚合猪血红蛋白样品。鉴定猪血红蛋白的纯度、聚合体分子量分布、携氧性能及自氧化等指标。结果猪血红蛋白在生理pH条件下的P50为23.6 mmHg,Hill系数为2.86。聚合猪血红蛋白为分子量大小不均一的混合体,聚合体P50和Hill系数均减小,自氧化趋势增大。结论猪血红蛋白具有较高氧亲和力,与人血红蛋白相似,明显高于牛血红蛋白。猪血红蛋白的丰富来源、特殊的氧亲和力和较好的化学稳定性等特点使其可成为一种血红蛋白类氧载体产品制备的有用材料。

新型定性-定量测定血红蛋白氧载体的检测系统Ⅲ.建立抗人源性氧载体类兴奋剂检测系统的初探

目的构建一种高通量蛋白芯片检测人血清中血红蛋白氧载体类兴奋剂的方法。方法用自制SEC微柱快速地将人血清中血红蛋白聚合体(氧载体)和血红蛋白单体(另外加入的内标)分离,逐滴收集洗脱液作为探针,点样结合在蛋白质基片上,与其相对应的荧光标记的多克隆抗体进行杂交,扫描芯片荧光强度检测人血红蛋白氧载体。结果自制SEC微柱能够将戊二醛聚合的人血红蛋白聚合体和单体有效分离,在蛋白芯片的检测中能较好地检测出人血清中1.5%的聚合体人血红蛋白氧载体。结论以SEC技术和蛋白芯片相结合是一种高通量、灵敏、重现性好的检测人血清中的以人血红蛋白为基质氧载体类兴奋剂新方法。