日本鳗鲡胶原蛋白和小清蛋白的过敏原性

以日本鳗鲡皮与肌肉组织为研究对象,采用碱溶、酸溶、盐析、冻干等方法纯化得到胶原蛋白,采用加热、饱和硫酸铵分级盐析、DEAE-Sepharose阴离子交换层析等方法纯化得到两种亚型的小清蛋白(PV-Ⅰ和PV-Ⅱ),纯化的目标蛋白经动物特异性抗体的免疫印迹实验确证。酶联免疫吸附测定和免疫印迹分析结果显示,纯化的胶原蛋白和小清蛋白分别与鱼类过敏患者阳性血清发生特异性反应,且二者之间无免疫交叉反应。体外模拟胃液消化实验和SDS-PAGE分析结果显示,胶原蛋白和小清蛋白均具有较高的消化稳定性。结果提示,日本鳗胶原蛋白和小清蛋白具有较高的消化稳定性和免疫原性,二者可引发不同患者的IgE介导特异性超敏反应。

甲壳类动物4种过敏原的序列分析、抗原表位预测及三维结构建模

目的探明甲壳类动物各种过敏原之间是否存在相似性,以期深入研究甲壳类食品过敏原的构效关系。方法应用生物信息学方法,分析预测了甲壳类动物的4种过敏原—原肌球蛋白(TM)、精氨酸激酶(AK)、肌球蛋白轻链(MLC)和肌质钙结合蛋白(SCP)的二级结构、亲水性、可塑性、抗原性、表面可及性、线性抗原表位和三维结构等。结果 TM为超螺旋结构,而AK、MLC和SCP均为复合蛋白,含有较多的Turn和Coil结构;TM、AK、MLC和SCP 4种过敏原的亲水性区域均在60%以上,可塑性区域约为50%,抗原性区域均在60%以上。TM、AK、MLC和SCP分别有11、10、4和4个线性抗原表位。TM、AK、MLC和SCP的三维结构建模结果与相应的二级结构预测结果一致,基本能够反映此4种过敏原的空间构象。结论通过生物信息学方法分析,同时获得了甲壳类动物4种过敏原TM、AK、MLC和SCP的分子特征、抗原表位及部分三维结构,可望为进一步采用实验方法研究其构效关系奠定理论基础。

拟穴青蟹新型过敏原肌质钙结合蛋白的纯化、鉴定及分子克隆

为进一步认识蟹类的过敏原,采用免疫印迹方法,分析发现甲壳类过敏患者血清能与拟穴青蟹肌浆蛋白中分子质量约为21 kD的蛋白质产生特异的IgE结合反应,结果显示该蛋白可能是蟹类新型过敏原。通过硫酸铵盐析、阴离子交换和凝胶过滤柱层析等方法对21 kD-蛋白进行分离纯化,采用Western blotting和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)确认纯化的21 kD-蛋白为肌质钙结合蛋白(sarcoplasmic calcium binding protein,SCP)。采用SMART-RACE(Switching Mechanism At RNA Termini-Rapid Amplification of cDNA Ends)的方法获得SCP的cDNA序列,该序列全长986 bp,开放阅读框为579 bp,编码193个氨基酸,其理论分子质量21.94 kD,等电点4.44。拟穴青蟹SCP与甲壳类动物SCP具有较高的同源性,与昆虫SCP的同源性较差;三级结构模拟分析显示,SCP含有5个螺旋-转角-螺旋结构区,即EF-手型结构区,并在其中两个手型结构区形成2个钙离子结合位点;进一步预测得到SCP的4个线性抗原表位和3个构象性抗原表位。

文蛤特异性过敏原免疫识别的初步研究

目的:贝类是人类最优质的食用蛋白资源之一,也是联合国粮农组织公布的八大类过敏食物之一,贝类过敏反应严重影响着过敏人群的身体健康和生活质量,为此开展贝类过敏原的识别检测研究很有必要。方法:通过问卷调查初步了解食物过敏现状,获取自诉贝类过敏患者血清和正常人阴性对照血清,采用特异性IgE检测试剂盒筛选贝类过敏血清,应用组织捣碎提取蛋白、聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹等实验方法研究文蛤特异性过敏原。结果:文蛤肌肉主要蛋白的相对分子量约为200kD以上、200、90、80、70、46、36和24kD,其中能被贝类过敏血清特异性识别的90kD组分约占文蛤肌肉总蛋白的10%～20%,且主要为盐溶性蛋白。结论:文蛤的特异性过敏原为90kD蛋白组分。

锯缘青蟹原肌球蛋白的过敏动物模型研究

目的建立锯缘青蟹(Scylla serrata)原肌球蛋白(tropomyosin,TM)的食物过敏性小鼠模型,并对其致敏性进行评价。方法锯缘青蟹TM以灌胃方式刺激小鼠使其致敏,并对小鼠粪便组胺、血清IgE以及脾脏细胞IL-4、IL-13、IFN-λ等淋巴因子的水平进行检测。结果 TM组小鼠均出现了不同程度的过敏症状,其血清IgE的含量是阴性对照组(生理盐水)小鼠的2倍;TM组实验小鼠IL-4、IL-13、IFN-λ的水平分别为(17.508±2.189)pg/ml、(3.150±0.434)pg/ml、(15.056±1.974)pg/ml,粪便中组胺含量为6 244.651 nmol/l,与阴性对照组小鼠相比均有显著差异(P<0.05)。结论锯缘青蟹TM以灌胃方式刺激小鼠,TM组小鼠出现了不同程度的过敏症状,其粪便组胺、血清IgE以及脾脏细胞IL-4、IL-13、IFN-λ等淋巴因子的水平与阴性对照组小鼠相比均有显著差异(P<0.05),建立的TM过敏动物模型可望为蟹类过敏的诊断和免疫治疗提供技术依据。

鲤肌肉肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶的分子克隆(英文)

肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(myofibril-bound serine proteinase,MBSP)是最近发现的一种蛋白酶。该酶参与肌原纤维蛋白的降解及鱼糜制品弹性的下降。但是,对该酶一级结构的研究,迄今为止,未有报道。本文根据已测定的鲤MBSP N-末端氨基酸序列以及丝氨酸蛋白酶活性中心保守序列设计兼并引物,结合RT-PCR技术实现了MBSP基因片段的扩增。再根据克隆到的MBSP片段序列设计基因特异引物,用于MBSP基因的5′和3′末端快速扩增。综合以上结果,鲤MBSP的全长被确定。序列分析表明,MBSP cDNA含有一732 bp的开放阅读框,编码243个氨基酸残基,其中信号肽长度为21个氨基酸残基。组成丝氨酸蛋白酶活性中心的氨基酸残基(His61,Asp107和Ser197)在MBSP中保守存在。成熟MBSP含有222个氨基酸残基,分子量为24.5 ku,比其天然蛋白的分子量30 ku略小。成熟MBSP的等电点为10.43。鲤MBSP与鲫MBSP,猪胰蛋白酶,牛胰蛋白酶,美洲鲽胰蛋白酶的同源性分别为80.6%,55.8%,55.3%和53.9%。而与仓鼠肌肉中具有胰凝乳蛋白酶性质的蛋白酶的同源性为39.2%。MBSP有高含量的赖氨酸残基(11.93%),此特性可能与该酶的肌原纤维结合特性有关。

海蜇皮营养成分分析及胶原蛋白的提取

研究了海蜇皮的营养成分,分别采用胃蛋白酶法和柠檬酸法提取海蜇皮胶原蛋白。结果表明,海蜇皮中总糖质量分数为0.6%,蛋白为1.1%,呈味氨基酸占总氨基酸的59.1%,色氨酸是海蜇皮的第一限制氨基酸。胃蛋白酶法提取条件:pH值2,胃蛋白酶质量分数4.5%,时间54h,料液比为1:2,提取率为32.76%;柠檬酸法提取条件:柠檬酸浓度0.4mol/L,时间78h,料液比1:3,提取率为18.73%。

米根霉、法夫酵母双菌共发酵淀粉生产虾青素的初步研究

对米根霉、法夫酵母共发酵淀粉生产虾青素进行了研究.摇瓶试验结果表明,米根霉、法夫酵母共发酵淀粉生产虾青素适宜的培养基为淀粉50g/L、1g KH2PO4/L、1g CaCl2/L、1g酵母膏/L、0.5g MgSO4/L、5g(NH4)2SO4/L,控制培养基初始pH为8.0、发酵温度为22℃及同时接种米根霉和法夫酵母有利于虾青素的合成.5L罐试验结果表明虾青素合成滞后于糖的利用,且分成两个增长阶段,虾青素的最大产量达2.48mg/L.这些试验结果不仅证实了共培养米根霉和法夫酵母发酵淀粉生产虾青素的理论可行性,而且为进一步利用淀粉为原料生产虾青素提供了试验参考.

茶多酚在蓝圆鲹保鲜中的应用与研究

研究茶多酚对蓝圆鲹贮藏过程中的保鲜作用,以组胺和挥发性盐基氮(TVB-N)为指标,通过改变茶多酚浓度、浸泡时间、浸泡pH以及贮藏温度研究蓝圆鲹在贮藏过程中品质的变化特性。实验结果显示:茶多酚浓度0.25%、pH6、浸泡时间30min、-3℃贮藏条件下,抑制组胺和挥发性盐基氮的效果最好。

水产品过敏原的研究现状和展望

水产品作为人类食物的重要来源之一,其市场和消费群体不断扩大。与此同时,由水产品引发的食物过敏也日益增多,在联合国粮农组织公布的八大类过敏食物中,水产品就占了两大类。水产品过敏原有小清蛋白(Parvalbumin)、鱼卵蛋白(如鲑鱼的硫酸鱼精蛋白)和胶原蛋白(Collagen)、原肌球蛋白(Tropomyosin,TM)、精氨酸激酶(Arginine kinase)、肌球蛋白轻链(Myosin light chain)、肌钙结合蛋白(Sarcoplasmic calcium binding pro-tein)、血蓝蛋白亚基(Hemocyanin subunits)等。基于此,本文重点概述了国内外水产品过敏原及其加工脱敏技术的研究现状,以及今后水产品过敏原研究的发展趋势。

加工处理方式对蟹类原肌球蛋白的消化稳定性和过敏原性的影响

在超声波处理对拟穴青蟹(Scylla paramamosain)过敏原(原肌球蛋白,Tropomyosin,TM)影响的研究基础上,本文采用超声波、微波、超声波结合蒸煮处理拟穴青蟹蟹肉,提取其蛋白粗提液,通过模拟胃肠液消化及SDS-PAGE电泳、Western-blotting、抑制性ELISA等方法分析TM的消化稳定性及过敏原性。结果显示,与未经处理的样品及非过敏蛋白相比,TM在超声波(200W,30℃)处理后降解较快;微波处理后TM的消化稳定性及过敏原性没有明显变化,超声波处理、超声波结合蒸煮处理后TM的消化稳定性及过敏原性明显降低。该结果提示,超声波、超声波结合蒸煮等加工处理方式可降低蟹肉的致敏性。

虾类过敏原的识别、纯化和检测技术研究

虾类是人类优质的食用蛋白资源之一,也是联合国粮农组织公布的八大类过敏食物之一。虾类过敏反应严重影响着过敏人群的身体健康和生活质量,为此开展虾类过敏原的识别、纯化和检测技术研究非常必要。通过问卷调查初步了解食物过敏现状,获取自诉虾类过敏患者血清和正常人阴性对照血清,采用特异性IgE检测试剂盒筛选虾类过敏血清。提取南美白对虾蛋白,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳及免疫印迹识别虾类过敏蛋白,并对患者识别率最高的虾类的主要过敏原进行分离纯化。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫印迹和酶联免疫吸附测定等方法对纯化虾蛋白进行检测分析。患者识别的南美白对虾致敏原的分子质量依次约为200、175、116、85和36kDa,通过硫酸铵盐析及等电点沉淀等方法可以得到电泳纯的虾主要过敏蛋白。免疫印迹结果证实纯化的虾蛋白是具有过敏原性的原肌球蛋白,在此基础上,建立了虾原肌球蛋白的酶联免疫吸附测定方法。

南五味子不同溶剂提取物抑菌活性及其组分性质研究

以金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等8种致病菌为供试菌,探讨南五味子不同溶剂提取物对致病菌的抑制作用。结果表明:水及乙醇提取物对8种致病菌均有良好的抑制作用,且乙醇提取物的抑菌活性大于水提取物。乙醇提取物对蜡样芽孢杆菌的抑制效果最好,抑菌圈直径达32.04 mm。乙醇提取物对蜡样芽孢杆菌、宋内氏志贺氏菌的MIC值和MBC值最低,分别为15.62 mg/mL和31.25 mg/mL。乙酸乙酯提取物仅对等G+菌(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、宋内氏志贺氏菌)具有较好的抑制作用。石油醚提取物对8种致病菌均没有抑制作用。定性分析显示,南五味子乙醇提取物含有黄酮、多酚、甾体、三萜、生物碱、香豆素与内酯等化合物。结论:南五味子乙醇提取物含有多种抑菌物质,对8种致病菌的抑制作用最强。

蓝圆鲹酶解条件的响应面法优化及其产物抗氧化活性的研究

采用木瓜蛋白酶和风味酶水解蓝圆鲹蛋白,用响应曲面分析法优化水解工艺条件,并以自由基清除率为指标,对水解产物的抗氧化活性进行研究。结果表明:木瓜蛋白酶最佳水解条件为温度55.5℃,加酶量1.85%,pH6.11,时间7h,此时水解度达到26.92%;风味酶最佳水解条件为温度56.0℃,加酶量1.64%,pH6.8,时间7h,此时水解度达到22.32%。不同水解时间的蓝圆鲹酶解液的自由基清除率不同,木瓜酶和风味酶酶解液对羟基自由基(·OH)、超氧阴离子自由基((O_2)^-·)和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)自由基最大清除率分别为63.87%和56.1%,69.81%和72.55%,68.67%和84.44%。

HPLC法测定采后莲雾果实中ATP、ADP及AMP的含量

为探讨采后贮期莲雾果实中腺苷酸含量以及能荷变化对果肉组织絮状绵软的影响,建立高效液相色谱法测定采后台湾＂黑珍珠＂莲雾果实中ATP、ADP和AMP含量的方法。采用Atlantis T3柱（5.0μm,4.6 mm×250mm,Waters）,流动相为磷酸盐缓冲液（20 mmol/L KH2PO4：20 mmol/L Na2HPO4,pH 7.0）,流速1.2 mL/min,柱温30℃,检测波长254 nm条件,结果 ATP、ADP和AMP在6.25~200μg/mL质量浓度范围呈现良好的线性关系。用沸水提取的样品中3种腺苷酸ATP、ADP、AMP的稳定性较好,加标回收率分别为93.71%（RSD=1.74%）、97.28%（RSD=3.42%）、98.17%（RSD=3.12%）。该方法具有较高的灵敏度与精密度,重现性好,可用于测定采后莲雾果实中的腺苷酸含量。

聚乙烯醇和海藻酸钠固定化柚苷酶的制备及其性质

以聚乙烯醇、海藻酸钠为载体,固定化柚苷酶;以戊二醛为交联剂,考察固定化工艺条件对酶活的影响,研究固定化酶的部分酶学性质。用高效液相色谱法分析柚苷酶的α-L-鼠李糖苷酶和柚苷酶活力,结果表明:最佳载体组合为11%聚乙烯醇与0.5%海藻酸钠;当缓冲液p H 4、戊二醛含量1%、交联时间0.5 h、吸附时间3 h、加酶量141 U/m L、硼酸4%、Ca Cl21%时,固定化酶活力达到最大值。柚苷酶固定化后,α-L-鼠李糖苷酶和柚苷酶活力的最适温度提高5℃,最佳活性p H值提高1.0,p H稳定性基本不变,温度稳定性下降5℃。α-L-鼠李糖苷酶、柚苷酶的米氏常数(Km)固定化后都增大;α-L-鼠李糖苷酶的最大反应初速度(Vmax)经固定化后减小,柚苷酶的Vmax增大。将固定化柚苷酶重复使用7次后,它的α-L-鼠李糖苷酶和柚苷酶残余活力分别保持71%与80%。

克氏原螯虾新型过敏原血蓝蛋白的鉴定及性质研究

以克氏原螯虾为研究对象,鉴定血蓝蛋白的理化性质及其过敏原性。酶联免疫吸附试验结果表明:6份甲壳类过敏患者血清与克氏原螯虾血淋巴发生特异性IgE反应,利用离心和柱层析方法从血淋巴中分离纯化到目的蛋白。SDS-PAGE分析显示纯化的目的蛋白由6个亚基(依次为68,72,76,82,84和88 ku)组成,采用兔抗凡纳滨对虾血蓝蛋白多克隆抗体的免疫印迹试验证实目的蛋白为血蓝蛋白。免疫印迹试验结果显示,纯化的血蓝蛋白与甲壳类过敏患者血清出现了特异的杂交显色条带,表明血蓝蛋白具有IgE结合活性。与克氏原螯虾主要过敏原(原肌球蛋白)相比,血蓝蛋白的糖含量为1.99%,热稳定性好,pH稳定性及对胃蛋白酶的耐受性不如原肌球蛋白,但比原肌球蛋白更耐胰液消化。综合血清学及理化性质分析结果,提示血蓝蛋白是克氏原螯虾的1种新型过敏原。

马尾松针系统溶剂提取物的抑菌活性比较研究

以金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等8种菌为供试菌,以石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇、无水乙醇和水为系统溶剂,探讨马尾松针提取物对致病菌的抑制活性。结果表明:非极性至极性溶剂提取物对8种致病菌均具有良好的抑制作用。无水乙醇提取物的抑菌活性优于其它试剂。乙醇提取物对宋内氏志贺氏菌的抑制效果最好,抑菌圈直径达19.04 mm。乙醇相对金黄色葡萄球菌、变形杆菌和宋内氏志贺氏菌的MIC最低,为2.5 mg/mL。乙醇相对金黄色葡萄球菌、变形杆菌和宋内氏志贺氏菌的MBC最低,为5 mg/mL。稳定性试验显示,马尾松针乙醇提取物经121℃、30 min热处理,对其抑菌活性无影响。当介质pH≤7时,提取物对供试菌的抑制能力随pH的升高而显著下降。紫外光照射对其抑菌活性基本无影响。

茶饮料中茶多酚的电化学检测

研究磷钼酸(以下简写为PMo12)在缓冲溶液中的电化学行为以及对茶多酚的电催化活性,结果表明,PMo12对溶液中茶多酚的氧化反应具有良好的催化活性。在茶多酚浓度2.5×10-4～1.25×10-3g/mL范围,响应电流与茶多酚浓度呈线性关系,线性回归方程:I(mA)=0.218c-0.0548,r=0.995。在此浓度范围检测茶饮料中茶多酚含量,具有快速、简便、准确的特点。本检测方法为茶多酚的快速检测提供了理论依据。

液相色谱检测乌龙茶水浸提物及其单宁酶水解产物中的儿茶素

目的:建立测定乌龙茶水浸提物中儿茶素的高效液相色谱(HPLC)方法,研究单宁酶对儿茶素成分的影响。方法:通过优化液相色谱的流动相组成,改善儿茶素的分离效果,缩短分析时间。利用液-质联用及全波长扫描鉴定乌龙茶水浸提物中的儿茶素,用回收率及相对标准偏差评价方法的适用性。以儿茶素成分的变化为指标,分析单宁酶对乌龙茶水浸提物的影响。结果:选用symmetry C18(3.0mm×250mm,5μm)色谱柱,在流速0.5mL/min,柱温30℃,检测波长278nm,进样体积20μL的条件下,优化得到的流动相为0.5%乙酸(A)和甲醇(B),梯度洗脱条件为0min:88%A;5min:88%A;16min:81%A;28min:76%A;32min:70%A;40min:88%A;45min:88%A;样品分析时间为45min。乌龙茶水浸提物中含有表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表没食子儿茶素(EGC)、没食子酰儿茶素(EC)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)、没食子儿茶素(GC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)等儿茶素以及没食子酸(GA)和咖啡因。用该方法检测乌龙茶中儿茶素组分,以上各种儿茶素的最低检出限在0.006～0.197μg/mL之间,定量检出限在0.019～0.656μg/mL之间,RSD在0.17%～1.57%之间,回收率96%～103%。经单宁酶作用后,乌龙茶水浸提物中酯型儿茶素(EGCG、GCG、ECG)被完全水解,同时GA和非酯型儿茶素(EGC、GC、EC)含量分别增加了2059.7%、66.4%、39.1%、54.3%。结论:本试验所建立的HPLC方法能高效分离乌龙茶水浸提物中的儿茶素,具有灵敏度高,精密度和准确性好的优点。单宁酶可高效水解乌龙茶水浸提物中酯型儿茶素。