猪细小病毒1型突变株分离鉴定及全基因组进化分析

旨在对猪细小病毒1型(PPV1)突变株生物学特性进行分析。对采自山东不同地区养猪场的67份流产胎儿组织样品进行PPV的分离和培养,经电镜观察和IFA试验进行鉴定,通过Overlap PCR对分离株进行全基因序列扩增,SnapGene V4进行序列拼接和比对,利用DNAMAN V6对基因组末端5′UTR和3′UTR二级结构进行展示和比较,应用MEGA V7进行遗传进化分析,最后利用多步生长曲线绘制对分离株在易感细胞内的增殖能力进行比较。共分离得到3株病毒,均鉴定为PPV1型毒株,分别命名为SDPV1、SDPV2和SDPV3,GenBank登录号分别为ON924737、ON924738和ON924739;3个分离株全基因序列长度基本一致,其中5′-UTR序列高度保守,呈Y型结构;而3′-UTR呈U型结构,个别碱基有所差异;VP2氨基酸序列中有5个非同义突变位点,分别为T20A、R82K、Q226E、D366N和K407N,为国内毒株首次发现。生长曲线显示,突变株生长趋势相对较快,与PPV-QN株相比,最高滴度相差10倍。报道了包含新型变异位点的PPV毒株的基因组特征。

犬源牛犬细小病毒和犬圆环病毒二联PCR检测方法的建立及应用

本研究旨在建立可同时检测犬源牛犬细小病毒(CBoV)和犬圆环病毒(CCV)的二联PCR检测方法,并对两种病毒病当前的流行情况进行监测和调查。分别将已发表的CBoV和CCV基因组序列进行同源性比对,选择高同源区段,应用Primer Primier 5计算机软件设计并合成了2对特异性扩增引物,目的片段大小分别为170 bp(CBoV)和239 bp(CCV)。分别提取CBoV和CCV重组质粒作为模板,进行二联PCR扩增试验。结果表明,本研究成功建立了可同时检测CBoV和CCV的二联PCR检测方法。并对其重复性、特异性和灵敏度进行验证,二联PCR最低检测限度为3.0 pg总DNA,而对犬细小病毒2型、犬瘟热病毒和犬副流感病毒的PCR检测结果均为阴性。对送检的30份病料进行检测,其中,4份为CBoV阳性,3份为CCV阳性,未检测到混合感染。综上所述,本研究所建立的CBoV和CCV二联PCR诊断方法特异性高,敏感性好,可用于临床犬腹泻病的流行病学调查。

禽腺病毒4型Fiber-2蛋白原核表达及间接ELISA的构建

禽腺病毒(FAdV)是世界范围内流行的禽类常见传染病病原,2015年暴发的由新型血清4型禽腺病毒(FAdV-4)引起的急性传染病,给养殖户造成巨大的经济损失。为做到早期诊断和检测,并防控、净化该病毒病,本试验利用Fiber-2蛋白建立了检测FAdV-4的ELISA方法。根据禽腺病毒4型SDJN0105株Fiber-2基因的核苷酸序列,经序列优化后合成1 440 bp基因序列,连入pET-30a(+)载体构建pET-30a(+)-Fiber-2重组质粒,在BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达Fiber-2蛋白,利用亲和层析柱纯化重组Fiber-2蛋白,经SDS-PAGE和Western-Blot鉴定后,以Fiber-2蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化建立检测禽腺病毒4型抗体的间接ELISA方法。结果表明,获得了以上清形式表达的重组Fiber-2蛋白,Western-Blot鉴定表明重组Fiber-2蛋白具有良好的免疫学活性;重组Fiber-2蛋白的最佳包被浓度为4.0μg/mL,待检血清最佳稀释度为1∶400;该方法特异性好,仅与禽腺病毒4型阳性抗体发生反应,敏感度可达1∶6400;批内和批间重复性变异系数均小于5%;构建的间接ELISA试剂盒在4℃环境下放置12个月仍然有效。本研究建立的禽腺病毒4型抗体间接ELISA检测方法特异性强、敏感性高、重复性好、保质期长,可用于禽腺病毒4型的监测和流行病学调查。

犬细小病毒VP2基因乳酸菌表达载体的构建及蛋白检测

本研究旨在克隆犬细小病毒VP2(CPV-VP2)基因,构建乳酸菌重组表达载体,以乳酸菌表达CPV-VP2目的蛋白,通过重组目的蛋白检测及分析,为CPV乳酸菌口服疫苗研究提供支撑。以PCR方法扩增CPV-VP2编码目的基因,纯化后连接表达载体pMG36e,构建重组乳酸菌表达载体p MG36e-VP2,电转至乳酸球菌MG1363感受态,经PCR鉴定、双酶切鉴定及测序分析,挑选阳性重组菌株,命名为:pMG36e-VP2-MG1363。使用诱导剂Nisin诱导表达,SDS-PAGE和Western Blotting鉴定重组蛋白。结果显示,成功构建重组表达载体pMG36e-VP2,SDS-PAGE,结果表明,重组目的蛋白分子大小约65 kD,与理论值相符; Western Blotting结果表明,重组目的蛋白可被犬源CPV阳性血清所识别,具有良好免疫反应性。本研究用乳酸菌成功表达犬细小病毒蛋白,为该病新型疫苗的研究提供基础。

水貂肠炎病毒山东株分离鉴定及生物学特性分析

【目的】本研究旨在研究水貂肠炎病毒(mink enteritis virus,MEV)的基因组遗传进化特征。【方法】对采自山东境内水貂养殖场的109份水貂腹泻样品进行MEV的分离和鉴定,利用血凝和血凝抑制试验、多步生长曲线绘制以及蛋白的三级结构模拟等,对分离毒株生物学特性进行分析,通过重叠PCR对分离株进行全基因扩增,使用MegAlign进行序列同源性比对分析,利用DNAMANV6对基因组5’末端和3’末端回文结构进行预测,应用MEGAV6进行遗传进化分析。【结果】共分离得到5株病毒,经电镜观察和间接免疫荧光试验鉴定为MEV毒株,分别命名为MUTQS-1-5,GenBank登录号分别为OK275645、OK275646、OK275647、OK275648和OK275649;各分离株5’-和3’-UTR分别由长回文序列组成,具有典型的细小病毒基因组末端的茎环样结构,NS1和VP2基因的推导氨基酸序列存在多个非同义突变位点,其中NS1蛋白的E/Q545V位氨基酸突变,以及VP2蛋白的F267Y、Y324I位氨基酸突变为首次在MEV上发现;生物学特性分析表明,上述突变并未明显改变病毒的血凝及血凝抑制效价、生长趋势和病毒粒子的空间构象。全基因序列系统发育进化树也显示,本次分离株处于同一分支上,与山东分离株SDNH亲缘关系最近。【结论】本研究报道了包含新型变异位点的MEV毒株的基因组特征,试验初步证实了新型变异位点的出现并未改变病毒的血凝性、抗原性以及在易感细胞内的增殖能力。以上研究结果为进一步开展病毒的流行病学与变异规律研究奠定了基础。

伪狂犬病病毒gE/gI/TK基因缺失对感染PK-15细胞的差异表达蛋白质组分析

为了研究伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)变异株3个主要毒力基因gE/gI/TK缺失对感染宿主细胞后蛋白表达的影响,探究PRV与宿主细胞相互作用的分子机制,将PRV SD-2017ΔgE/gI/TK株接种PK-15细胞,运用串联质谱标签(tandem mass tags,TMT)标记定量蛋白质组学技术,开展PRV感染细胞后差异表达蛋白分析,并通过Western blot进行数据验证。通过生物信息学分析发现,与亲本毒株PRV SD-2017感染组比较,SD-2017ΔgE/gI/TK感染组共鉴定到19个差异表达蛋白,其中7个蛋白上调,12个蛋白下调;与传统疫苗株Bartha-K/61比较,SD-2017ΔgE/gI/TK感染组共鉴定到176个差异表达蛋白,其中157个蛋白上调,19个蛋白下调。这些差异蛋白主要与紧密连接、RNA降解途径、核糖体生物发生、B细胞受体等信号通路有关,其中ATP2A1、KDM8、Eri1、XRCC6、DNM2和PYCR2等差异蛋白参与细胞凋亡、免疫反应和自噬相关功能。通过Western blot验证了MYLPF、ERI1、XRCC6和GAMT的表达情况与TMT比率一致,证明了该数据的可靠性。本研究为进一步探讨PRV变异株的致病和免疫机制奠定了理论基础。

非洲猪瘟病毒免疫学及疫苗研究进展

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种动物烈性传染病,发病率和死亡率高,是世界动物卫生组织(OIE)规定的强制报告疫病,我国将其列为一类动物疫病。由于缺乏临床可用的疫苗等预防手段,该病在非洲、东欧、北高加索、俄罗斯等范围内蔓延,并于2018年8月传入我国,对我国养猪业造成了重大经济损失。本文总结了ASFV免疫学和疫苗研究的现状,阐述了其病毒结构与蛋白功能、感染与免疫机制,分别介绍了ASFV灭活疫苗、减毒活疫苗、基因工程疫苗的研究进展,以期对非洲猪瘟疫苗的开发起到借鉴作用。

一株水貂博卡病毒全基因组扩增及序列分析

本研究旨在研究水貂博卡病毒(Mink bocavirus,MBoV)在山东省的流行状况及基因特征。采用PCR对采自山东省境内水貂养殖场的85份水貂腹泻样品进行MBoV检测,挑选1份单阳性样品进行全基因扩增,使用MegAlign进行序列同源性比对分析,利用DNAMAN V6对基因组5’末端和3’末端回文结构进行预测,应用MEGA V6进行遗传进化分析。结果表明,所采集的腹泻样品中MBoV阳性率为3.5%(3/85),其中1份为MBoV单阳性,2份为MBoV与水貂肠炎病毒(Mink enteritis virus,MEV)双阳性。获得MBoV全基因序列1条(SDMBoV2020),全长5 252 bp;经分析,5’-和3’-UTR分别由98和145 bp短回文序列组成,具有典型的细小病毒末端的茎环样结构;基因组含有3个ORFs,分别编码非结构蛋白NS1、NP1以及结构蛋白VP1和VP2;SDMBoV2020与NCBI登录的MBoV参考毒株KU950356各编码基因的推导氨基酸序列同源性较高,为98.5%~99.0%;基于MBoV全基因序列构建的系统发育进化树也显示,SDMBoV2020和参考毒株KU950356株同处于MBoV 1型基因群分支上,亲缘关系较近。