蓝莓叶斑病病原菌鉴定及其生物学特性

为明确山东省蓝莓叶斑病病原菌的种类及其生物学特性,采用组织分离法获得菌株B1,通过形态学特征并结合r DNA-ITS序列分析对该菌株B1进行鉴定,以离体和活体叶片接种法测定菌株B1的致病性,并对其生物学特性进行研究。结果表明,菌株B1菌落呈白色绒毛状,背面淡黄色,分生孢子纺锤形,5个细胞,中间3个细胞为褐色,具有2～4根顶端附属丝;菌株B1的ITS序列与GenBank中棒状拟盘多毛孢Pestalotiopsis clavispora的相似性达99%以上,结合形态特征与rDNAITS序列分析将病原菌鉴定为棒状拟盘多毛孢,GenBank登录号为MG009201。菌株B1接种蓝莓叶片后产生褐色病斑,后期密生黑色分生孢子盘,与蓝莓田间自然发病症状一致。该菌株在5～35℃、pH 5～11范围内均可生长,最适温度范围为25～30℃,最适pH范围为5～9;但仅在25～30℃时产生分生孢子,最适产孢温度为25℃;光照条件对菌丝生长无明显影响,但连续黑暗有利于产孢;以葡萄糖为碳源时利用率最高,对乳糖利用效果最差;最适氮源为硝酸钠、硫酸铵和蛋白胨,几乎不能利用尿素。

BHT对苹果采后灰霉病的防效及防御酶活性和丙二醛含量的影响

为探究2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol,BHT)对苹果采后灰霉病的防效和防病机制,采用平板法和刺伤接种法测定了BHT对灰霉病菌Botrytis cinerea的抑制作用及果实内防御酶活性和丙二醛含量的影响。结果表明,0.1 mmol/L BHT对苹果灰霉病的防效最佳,处理苹果后间隔48~96 h接种灰霉病菌,其防效可达68.59%~73.55%,其次为0.2、1.0 mmol/LBHT处理,但防效均低于52.94%。0.1 mmol/L BHT处理对灰霉病菌菌丝生长和分生孢子萌发无显著抑制作用,但可显著增强果实内超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶的活性以及总抗氧化能力,其峰值是对照的1.82~5.28倍,且均显著高于单独接种灰霉病菌的处理。此外,单独接种灰霉病菌的苹果果实内丙二醛含量快速升高,最大增幅达251.49%,而BHT处理后丙二醛含量变幅较小,最大增幅仅为83.95%。表明BHT可通过增强苹果果实内防御酶活性水平和总抗氧化能力来降低丙二醛的积累,从而提高果实对灰霉病的抗性。

BHT对苹果果实轮纹病的防效及防御酶活性的影响

以‘富士’苹果果实为材料,采用刺伤接种法,测定了2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)对苹果果实轮纹病的防效及其防病机制。结果表明:0.1 mmol·L-1的BHT处理后间隔48~72 h接种轮纹病菌,其防效最高达74%以上,而该浓度BHT对轮纹病菌菌丝生长和分生孢子萌发均无明显的抑制作用。BHT处理后接种或不接种轮纹病菌,果实内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性以及总抗氧化能力(T-AOC)均显著升高,其峰值是对照的1.82~4.56倍,且在测定时间内始终显著高于对照。同时,BHT处理的果实内丙二醛(MDA)含量变化较小,最高增幅仅为78.94%,而接种轮纹病菌的处理,MDA含量急速上升,最大增幅为316.77%。表明BHT通过持续提高‘富士’果实内防御酶活性和总抗氧化能力,同时降低膜脂过氧化产物MDA的积累,从而诱导果实对轮纹病的抗性。

苹果MpSNAT1的克隆与表达特性分析

以‘富士’和‘嘎啦’苹果(Malus pumila)叶片总RNA为模板,克隆5-羟色胺-N-乙酰基转移酶(SNAT)基因,利用DNAMAN、MEGA 5.1等软件对该基因进行生物信息学分析,采用荧光定量PCR技术测定SNAT的表达水平。结果表明,获得的苹果SNAT全长c DNA序列为750 bp,编码249个氨基酸,命名为Mp SNAT1(登录号MF443136)。Mp SNAT1编码蛋白的理论分子量约27.8 k Da,为非分泌型、亲水的不稳定蛋白,具有乙酰基转移酶(GNAT)功能结构域。序列多重比对及系统进化树分析表明,Mp SNAT1编码氨基酸序列与桃和拟南芥的同源性高,一致性分别为91.2%和63.6%。炭疽叶枯病菌接种后,苹果叶中Mp SNAT1表达量升高,但‘富士’和‘嘎啦’中基因上调水平和持续时间存在显著差异。此外,外源褪黑素处理后,苹果叶中Mp SNAT1显著上调表达,但外源水杨酸(SA)处理后,Mp SNAT1表达量均不同程度降低,表明该基因表达不受SA诱导。

苹果木葡聚糖酶抑制蛋白基因的克隆与表达分析

以‘富士’苹果(Malus pumila)树皮总RNA为模版,利用RT-PCR技术克隆木葡聚糖酶抑制蛋白基因,命名为Mp XEGIP1。通过生物信息学软件对基因c DNA序列、系统进化关系及理化性质进行分析,采用荧光定量PCR技术测定Mp XEGIP1的表达量。构建原核表达载体p ET-Mp XEGIP1,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),利用SDSPAGE和western blot检测和验证融合蛋白的表达。结果表明,获得了Mp XEGIP1的全长c DNA序列(登录号MG515243),开放阅读框1 344 bp,编码447个氨基酸。Mp XEGIP1编码蛋白的理论分子量约48.77 k Da,为亲水的不稳定蛋白;57~419位氨基酸为木聚糖酶抑制蛋白保守域。序列多重比对及系统进化树分析表明,Mp XEGIP1编码氨基酸序列与‘金冠’苹果XEGIP完全一致,其次与梨XEGIP序列相似性81%,三者亲缘关系较近。‘富士’枝条接种腐烂病菌后,Mp XEGIP1显著上调表达。原核表达和western blot分析表明,该蛋白以包涵体形式存在,能与HIS抗体特异性结合,证实Mp XEGIP1编码蛋白得到成功表达。