同时检测四种病原菌的PCR方法研究

(目的)为建立一种同时检测四种常见动物源致病菌的PCR方法。(方法)本研究针对大肠杆菌的(16 s-23 s rRNA)基因、金黄色葡萄球菌的(nuc)基因、单增李斯特氏杆菌的(hlyA)基因以及沙门氏菌的(invA)基因分别设计合成了四对特异性引物,PCR扩增的目的基因片段分别为662 bp、484 bp、372 bp、284 bp,并对多重PCR反应条件进行了优化。(结果)建立的多重PCR方法具有敏感、特异、准确、快速的优点,检测时间为4h左右。(结论)为研发同时检测人畜共患病食源性主要致病菌即大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏杆菌及沙门氏菌的试剂盒奠定了基础。

鸡肉保鲜抑菌中草药的筛选及稳定性研究

本试验通过分析18种中草药提取液对假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌和沙门氏菌等5种菌的抗菌活性筛选出对鸡肉起到保鲜抑菌作用的中草药。结果表明:黄连、肉桂、丁香、苦参和苦丁5种提取液对鸡肉主要腐败菌均表现抑制作用,抑菌效果较好,本试验还测定了其最低抑菌浓度。用5种提取液进行1∶1∶1配伍的10种复配液对供试菌的抑菌试验,表明复配液FP7、FP8和FP10是其中效果较好的配伍。

近红外光谱法检测鸡、鱼肉加热终点温度

【目的】在肉制品生产中,加热终点温度(endpoint temperature,EPT)是控制食源性疾病的关键因素。现有的EPT检测方法诸多,如酶活性测定法,凝血试验和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE电泳)法等,但普遍存在耗时、样品处理繁杂等不足。采用近红外光谱(near-infrared spectroscopy,NIR)结合偏最小二乘法(partial least squares,PLS)检测鸡、鱼肉加热终点温度,为研究近红外光谱法检测肉类EPT的可行性提供参考。【方法】分别将肉样以1℃·min^(-1)的升温速率进行9个不同温度的加热处理(50、55、60、65、70、75、80、85和90℃),当达到终点温度时,迅速取出,冰水冷却到4℃。冷却后的肉样和释放的肉汁同时放到均质机中,均质1 min,绞碎成肉糜状。均质后的肉样存放于4℃的冰箱中,共制得144个样品(鸡、鱼肉样品数分别为77和67)。在近红外光谱仪上,采用硫化铅(Pb S)检测器和旋转样品池,每个样品连续采集光谱3次,在11 000—4 000 cm-1波数范围内,以8 cm^(-1)的分辨率扫描64次。将所采集的鸡、鱼肉的光谱数据分别随机分为校正集(样品总数108,其中鸡肉样58,鱼肉样50)和检验集(样品总数36,其中鸡肉样19,鱼肉样17),校正集用于校正模型的建立,检验集用于检验模型的预测能力。在建立模型时,采用标准正则变换、一阶微分和Norris Derivative滤波平滑(N-D)3种方法结合对原始光谱进行处理,采用内部交叉验证均方差(cross-validation mean square error,RMSECV)确定主成分数,利用模型对检验集样品的预测均方差(prediction mean square error,RMSEP)、预测值与实测值间的相关系数r及预测标准差σ考察模型的预测性能。【结果】采用校正集的内部交叉验证均方差(RMSECV)确定鸡肉、鱼肉的主成分数分别为9和11,此时校正集的RMSECV值最小,分别为1.59%和0.96%;所得校正模型的预测温度与实际加热温度之间的相关系数分别为0.9844和0.9936;由所建模型对检验集样品的检验结果可看出,实际加热温度与近红外模型预测的加热温度具有很高的相关性,预测值的相关系数r分别为0.9966和0.9832;预测均方差RMSEP分别为3.02%和2.94%;预测标准差σ为0.97和1.63。【结论】本研究所建模型具有很好的预测性能,近红外光谱用于肉制品EPT检测具有很大潜力。

四种植物提取物对肉鸡生长性能、肠道及排泄物生化指标的影响

观察比较了樟科(CFPE)、丝兰(YE)、一串红(SS)和桂花(OFL)植物提取物对肉鸡生产性能、肠道和排泄物生化指标的影响。将300只0日龄AA肉鸡随机分为5组:即肉桂、丝兰、一串红和桂花提取物各添加200 mg/kg为试验组,以基础日粮为对照组。每个试验组3次重复,每重复20只。结果表明,与对照组相比,各试验组均可显著提高日增重,降低料肉比(P<0.05),显著改善肉鸡肠道内容物和排泄物的生化指标(P<0.05):氨态氮、尿素氮、尿酸含量及脲酶活性较对照组呈下降趋势;同时抑制了产脲酶、尿酸酶、尿囊素酶菌以及一些肠道有害细菌的生长,直接抑制粪中尿酸酶活性,从而有效地减少了氨气的逸放,降低其对肉鸡的应激,进而生长性能各项指标都有了改善。

山羊IL-18成熟蛋白在昆虫细胞／杆状病毒中的表达及其活性分析

目的:在昆虫细胞/杆状病毒中表达山羊白介素18(gIL-18)成熟蛋白,并对其生物学活性进行分析。方法:将编码山羊白介素18(gIL-18)成熟蛋白的基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBac Dual上,构建重组质粒pFastBac Dual-gIL18,将该重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-gIL18,在Cellfectin作用下,将Bacmid-gIL18转染昆虫细胞sf9,收获感染后不同时间段的细胞,进行SDS-PAGE、Western blot检测和生物学活性分析。结果:重组蛋白获得正确表达具有良好的免疫原性;生物学活性分析表明,重组蛋白能够促进淋巴细胞增殖、诱导淋巴细胞分泌IFN-γ。结论:用昆虫细胞/杆状病毒系统成功表达了gIL-18成熟蛋白,且具有良好的免疫原性和生物学活性,从而为进一步研究gIL-18作为免疫调节剂和免疫佐剂在生产上的应用奠定了基础。

一株鸡源嗜铅乳酸菌的筛选鉴定

试验目的是从肉鸡的肠道内容物及排泄物中筛选出具有铅抗性的细菌，用于重金属铅的去除。采用涂布平板技术从采集的样品中共分离筛选到8株具有较好铅抗性和吸附性的菌株，其中JT1菌株对铅的抗性（800 mg/L）和去除能力（66．95％）最高。通过培养特征、形态观察、生理生化鉴定、16S rDNA序列分析等方法证明，所得JT1菌株为屎肠球菌（Enterococcus faecium）。该菌株可以在10～45℃、pH 4．5～9．6、6．5％NaCl溶液、0．8％胆盐、0．1％胰蛋白酶浓度条件下生长良好。

耐铅屎肠球菌JT1与非耐铅屎肠球菌M差异蛋白解析研究

采用蛋白质组学技术研究具有耐铅性的屎肠球菌JT1菌株,以期获得其与非耐铅屎肠球菌M菌株的差异蛋白质序列。首先利用二维凝胶电泳建立耐铅乳酸菌的蛋白质图谱,对比上述2种菌株的蛋白质图谱,找出显著表达的差异蛋白点,再进行质谱鉴定,继而对相关的差异蛋白进行蛋白质的生物信息学分析。研究结果表明:得到21个差异点对应的19种差异蛋白主要分为6类功能蛋白,分别是细胞胁迫响应蛋白、糖类代谢蛋白、小分子代谢蛋白、核酸代谢蛋白、细胞增殖蛋白、蛋白质代谢蛋白;其中,半胱氨酸合成酶A是与小分子代谢相关的蛋白,在有氧生长中能增加半胱氨酸和胱硫醚-β-合成酶的酶活,半胱氨酸则与Pb^(2+)等金属离子可形成不溶性的硫醇盐,进而使菌体能够抵抗氧化胁迫,对Pb^(2+)造成的活性氧增加引起的细胞结构损伤有着良好的缓解作用,从而提高菌株耐铅性;此外半胱氨酸合成酶还与谷胱甘肽的合成相关,谷胱甘肽可以提升菌体抗酸胁迫和抗毒胁迫的能力,增加JT1菌株对Pb^(2+)的抗渗透力,以及作为直接作用细胞内金属离子的螯合剂。

食源性致病菌快速检测方法的建立与应用

目的:建立一种快速检测空肠弯曲杆菌、副溶血弧菌和小肠结肠炎耶尔森菌的多重PCR方法,并进行市场采样检测。方法:根据空肠弯曲杆菌的hipO基因、副溶血弧菌的tlh基因和小肠结肠炎耶尔森菌的Ail基因的特异性抗原基因序列,设计3对特异性引物,优化各种工作条件;测定特异性和灵敏度,建立一种多重PCR检测方法,并对泰安农贸市场采集的409份样本进行检测。结果:建立的多重PCR方法可以快速、简便地检测3种目的菌;对6种食源性致病菌的检测结果表明,该方法特异性很好,灵敏度高。空肠弯曲杆菌的检出极限为3.0×101cfu/mL,副溶血弧菌的检出极限为6.2×101cfu/mL,小肠结肠炎耶尔森菌的检出极限为1.5×101cfu/mL。样本中空肠弯曲杆菌、副溶血弧菌和小肠结肠炎耶尔森菌的阳性率分别为20.8%,1.5%和13.2%。结论:采用该方法可在5h内得到检测结果,具有操作简便,检测周期短,敏感度和特异性高等优点,为进一步开发空肠弯曲杆菌、副溶血弧菌和小肠结肠炎耶尔森菌快速检测试剂盒及其产业化奠定了基础。

鸡白介素18成熟蛋白突变体在毕赤酵母中的高效表达及其生物活性检测

【目的】通过目的基因克隆,表达获得高产量具有生物活性的鸡白介素18成熟蛋白（maturechickeninterleukin-18,mChIL-18）。【方法】根据毕赤酵母密码子偏嗜性,通过引物设计来定点突变鸡白介素18基因,构建了重组质粒pPIC9K-mChIL-18。将线性化的重组阳性质粒电转到毕赤酵母GS115中,经筛选多拷贝阳性子后进行诱导表达。用MTT法和微量细胞病变抑制法检测其生物活性。【结果】筛选的多拷贝重组菌在诱导温度为28℃,培养液pH值为6.5,甲醇的诱导浓度为2%,诱导时间为120h时表达量最高,约为480mg/L。表达的mChIL-18蛋白能够刺激SPF鸡淋巴细胞大量增殖,用400μg/L的mChIL-18诱导淋巴细胞产生γ-干扰素（IFN-γ）,其生物活性最高可达1.7×104U/mL,且能有效抑制水泡性口炎病毒（VSV）在鸡胚成纤维细胞（CEF）上的生长。【结论】毕赤酵母能够高效表达具有生物活性的鸡白介素18,有望作为免疫佐剂运用到工业化生产和兽医临床中。