人巨细胞病毒p52蛋白基因的克隆及表达

目的制备人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）ｐ５２蛋白特异性抗原。②方法用ＰＣＲ技术扩增ＨＣＭＶｐ５２蛋白ＩｇＭ抗原决定簇编码区ＤＮＡ片段，克隆到表达载体ｐＢＶ２２０中，转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α株，用氨苄青霉素抗性和质粒酶切图谱分析法筛选阳性克隆，经温控诱导其表达。③结果重组克隆能有效表达天然蛋白ｐ５２，ＥＬＩＳＡ检测重组ｐ５２蛋白具良好的抗原特异性。④结论通过基因工程制备的重组ｐ５２蛋白可作为ＨＣＭＶ血清学诊断的良好抗原。

胃癌组织中PTEN基因突变的研究

目的:研究抑癌基因PTEN突变高发区外显子5穴exon5雪和外显子8穴exon8雪在胃癌组织中的突变频率,探讨其突变与胃癌病理组织学分级和临床病理分期的关系。方法:应用聚合酶链反应鄄单链构像多态性分析(PCR鄄SSCP)方法检测胃癌组织和相应癌旁正常组织中PTEN基因的突变,并对突变样本的PCR产物进行测序分析。结果:42例胃癌组织中检测到PTEN基因突变3例,其中exon5突变1例,exon8突变2例,突变率为7.14%(3/42);42例相应癌旁正常组织未检测到突变,二者差异无统计学意义(P>0.05)。对42例胃癌进行组织学分级,低分化腺癌突变率为12.00%(3/25),中、高分化腺癌突变率为0(0/17),二者差异无统计学意义(P>0.05)。对42例胃癌临床病理分期,Ⅰ、Ⅱ期突变率为5.88%(1/17)熏Ⅲ、Ⅳ期突变率为8.00%(2/25),二者差异无统计学意义(P>0.05)。结论:胃癌组织中存在PTEN基因突变;主要发生在低分化腺癌中;而PTEN基因突变与胃癌病理组织学分级和临床病理分期之间无明显相关性。

PTEN基因突变与胃癌临床分期相关性的探讨

目的:分析抑癌基因PTEN突变高发区外显子5(exon5)和外显子8(exon8)在胃癌组织中的突变频率,探讨其突变与胃癌临床分期的相关性。方法:应用聚合酶链反应-单链构像多态性分析(PCR-SSCP)方法检测胃癌组织和相应癌旁正常组织中PTEN基因的突变,对突变样本的PCR产物进行测序分析。结果:42例胃癌组织中检测到PTEN基因突变3例,突变率为7.14%(3/42);42例胃癌临床病理分期,Ⅰ、Ⅱ期突变率为5.88%(1/17),Ⅲ、Ⅳ期突变率为8.00%(2/25),二者差异无统计学意义(P〉0.05)。42例相应癌旁正常组织未检测到突变。42例胃癌进行组织学分级,低分化腺癌突变率为12.00%(3/25),中、高分化腺癌突变率为0(0/17),二者差异无统计学意义(P〉0.05)。结论:胃癌组织中存在PTEN基因突变,主要发生在低分化腺癌中,而PTEN基因突变与胃癌病理组织学分级和临床病理分期之间无明显相关性。

HSV-1包膜糖蛋白G重组蛋白的纯化与抗原性分析

①目的 纯化原核表达的HSV 1包膜糖蛋白G重组蛋白并对其抗原性进行分析。②方法 应用亲和层析法纯化重组蛋白 ,Western印迹和ELISA法检测分析其抗原性。③结果 Western Blot检测 15份HSV 1IgM阳性血清 ,其中 12份血清可与重组蛋白发生反应 ;ELISA法检测 5 35份血清 ,与商品化同类试剂盒相比符合率为 89.7% .④结论 该重组蛋白检测HSV 1活动性感染有较高的应用价值。

大肠杆菌表达耐热DNA聚合酶的纯化和鉴定

目的探讨工程菌表达的耐热ＤＮＡ聚合酶的纯化方法。②方法收集ＩＰＴＧ诱导带有耐热ＤＮＡ聚合酶（ＴＤ聚合酶）基因表达质粒的工程菌株ＤＨ－ＴＤ４，用溶菌酶裂解，６０℃处理后，上清液用硫酸铵沉淀，根据溶解度差异进行粗分级，然后进行离子交换层析细分级，并经聚合酶链式反应（ＰＣＲ扩增）鉴定其活性。③结果纯化的ＴＤ聚合酶具有良好的聚合活性。④结论溶解度差异与离子交换层析是工程菌表达的耐热ＤＮＡ聚合酶纯化的主要步骤。

1992～1994年HIV-1国际流行株和云南株膜蛋白V3区氨基酸共有序列比较

对１９９２～１９９４年间１６个云南ＨＩＶ１株膜蛋白基因Ｖ３区进行了ＤＮＡ序列测定，经计算机ＤＮＡＳＩＳ及ＰＲＯＳＩＳ软件进行同源性分析，得出其相应的氨基酸共有序列ＹＮＶ３和两组共有序列ＹＮＶ３Ａ和ＹＮＶ３Ｂ，计算了ＹＮＶ３中每个氨基酸的保守性。分别将ＹＮＶ３Ａ和ＹＮＶ３Ｂ与世界各地的ＨＩＶ１代表株的相应序列进行了同源性比较。结果表明，ＨＩＶ１云南株膜蛋白Ｖ３区氨基酸共有序列ＹＮＶ３中每个氨基酸的平均变异度为７．６６％。两组共有序列ＹＮＶ３Ａ和ＹＮＶ３Ｂ，分别与ＨＩＶ１美欧株及泰国流行株Ｂ亚群相应序列有较高同源性。这一结果提示，在进化上云南瑞丽ＨＩＶ１流行毒株间有非常密切的关系，在这一时期该地区的流行毒株以ＨＩＶ１美欧株、泰国株Ｂ亚群及其衍生株为主。

透析对糖尿病肾衰竭病人外周血单个核细胞TGF-β_1 mRNA表达的影响

1目的 探讨透析对糖尿病肾衰竭病人转化生长因子 (TGF- β1 )表达的影响。2方法 采用逆转录聚合酶链反应 (RT- PCR)半定量技术 ,对糖尿病肾衰竭不同治疗组病人外周血单个核细胞 (PBMC) TGF- β1 m RNA的表达进行检测。 3结果 糖尿病肾衰竭透析病人 TGF- β1 m RNA的表达明显高于对照组 (t=12 .5 30 ,P<0 .0 1) ,且血液透析病人 TGF- β1 m RNA的表达较腹膜透析病人高 (t=2 .134 ,P<0 .0 5 )。 4结论 血液透析可使糖尿病肾衰竭病人 TGF- β1

运用SELDI蛋白质芯片技术检测Vero细胞感染HSV-1后蛋白质的差异表达

目的运用SELDI(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization)蛋白质芯片技术检测Vero细胞感染HSV-1后蛋白质的差异表达,从而为从蛋白质水平研究HSV-1感染的致病机制奠定基础。方法常规培养Vero细胞,感染HSV-1,孵育12 h、24 h、48 h后用细胞裂解液裂解细胞。裂解上清经蛋白定量后应用IMAC3(固定金属亲和)和WCX2(弱阳离子交换)芯片,SELDI-TOF-MS技术检测细胞感染HSV-1前后蛋白质表达的差异。结果感染24 h细胞出现明显细胞病变效应(CPE),感染12 h质谱分析即可见蛋白的差异表达。共19个蛋白表达水平发生变化,其中IMAC3芯片发现差异峰9个,WCX2芯片发现差异峰10个。结论 SELDI蛋白质芯片技术检测Vero细胞感染HSV-1后蛋白质的差异表达方法简便,敏感性高,从而为从蛋白质水平研究HSV-1感染的致病机制,HSV-1与宿主细胞的相互作用,及抗感染治疗靶位的寻找奠定了一定的基础。

山东省丙型肝炎病毒分离株NS5区核苷酸序列分析

目的 了解山东省丙型肝炎病毒 (HCV)分离株的基因型及其基因的变异情况。方法 应用德国UBIHCVEIA 4 .0诊断试剂盒筛选山东省部分地区 64例临床检验为抗 HCV阳性的血清标本 ,有 54例阳性。随意抽取其中 2 8例 ,应用逆转录套式 聚合酶链反应 (RT nested PCR)扩增3 1 9bp的HCVNS5区基因片段 ,结果 1 2例出现特异性条带。随后将这 1 2个NS5区片段直接进行T载体克隆 ,并用Sanger法对克隆成功的 1 0个NS5区基因片段进行序列测定。将所得到的 1 0个序列与GenBank中所有的HCV分离株进行同源性比较。结果 1 0例山东省部分地区HCV分离株的基因型均属于HCV 1b型。对获得的 1 0个NS5区片段进行变异性分析发现 ,所有的核苷酸变化都是由于替代作用引起的 ,没有碱基的插入和缺失 ;大部分的突变都属于同义突变 ,占突变总数的 74 %。RNA 依赖性RNA聚合酶的G D D基序和所有的半胱氨酸都完全保守。结论 本研究证明了HCV

人类免疫缺陷病毒1型云南株外膜蛋白原核表达克隆的构建

目的为研究我国云南１型人类免疫缺陷病毒（Ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｖｉｒｕｓｔｙｐｅ１，ＨＩＶ－１）流行株外膜蛋白（ｇｐ１２０）的有关抗原表位。方法采用套式聚合酶链式反应，以来自云南流行区ＨＩＶ－１感染者的外周血单核巨噬细胞基因组为模板，进行云南流行株外膜蛋白基因（ｅｎｖ）片段的扩增，并将ｅｎｖ基因片段与原核表达载体ｐＢＶ２２０进行重组，构建成质粒ｐＹＮｅｎｖ并在大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ１０ｂ）中获得表达。采用限制性内切酶分析进行重组质粒的鉴定。结果含重组质粒的宿主菌经３０℃２０小时培养后，转入４２℃培养５小时，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳分析有重组蛋白的表达。经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ反应证实，该重组蛋白可与来自该流行区的ＨＩＶ－１感染者血清（含多克隆抗体）发生特异反应。结论该重组膜蛋白可作为抗原用于ＨＩＶ－１膜蛋白抗体的检测，并为进一步研究ＨＩＶ－１ｇｐ１２０的病理机制奠定了基础。

云南瑞丽静脉药瘾人群HIV1感染者毒株env基因V3区序列测定研究

为了解云南瑞丽静脉药瘾人群HIV1感染者毒株的分子流行病学特征 ,运用套式聚合酶链反应 (nestedPCR)对来自云南静脉药瘾人群的 16株HIV1env基因V3区进行扩增 ,并对扩增片段进行DNA序列测定和分析。结果显示 ,与本地区共享序列相比 ,16株HIV1膜蛋白V3区氨基酸序列的株间变异为 0 %～ 2 3% ,平均为 7%。HIV1云南株膜蛋白V3区氨基酸共享序列与HIV1SF2株及美欧株共享序列同源性在 90 %以上 ,而与海地、日本及非洲等地的代表毒株同源性较低。结果表明 ,在进化上这16株HIV1毒株间有非常密切的关系。这一地区的流行毒株在这一时期以美欧株、HIV1SF2株及其衍生株为主。

1990～1997年云南IDUs HIV-1B亚型分离株膜蛋白V3环顶端四肽基因序列的变化趋势

目的 观察云南静脉药瘾 (IDUs)HIV 1分离株env基因V3环顶端四肽氨基酸和相应核苷酸序列随时间推移的变化。方法 根据 1990～ 1997年间 6 2株HIV 1分离株env基因C2 V3区DNA序列 ,对HIV 1膜蛋白V3环顶端四肽基因序列 (基序 )及其编码核苷酸进行分析 ,并探讨其随时间推移的变化趋势。结果 1990～ 1997年间 6 2株HIV 1毒株膜蛋白V3环顶端四肽基序有程度不同的氨基酸变异 ,主要表现在第四位氨基酸的改变 ,变异呈现一定的趋向性。 6 2株云南标本中有 46例(74 2 % )为GPGR ,10例 (16 1% )为GPGQ ,4例 (6 4% )为GPGK ,另有 2例 (3 3% )为GPER且四肽基序编码核苷酸的变异主要表现为A→G的改变。结论 1990～ 1997年这一时期内 ,云南IDUs特定感染者范围内HIV 1分离株膜蛋白V3环顶端四肽序列已表现出较大的趋向性 ,符合HIV

HIV1膜蛋白PND编码基因自然变异株的发现

目的 对 1例来自华东地区HIV1分离株 (WWBH7)的前病毒env基因C2 V3区进行序列分析。方法 以HIV1感染者外周血单个核细胞基因组为模板进行套式PCR扩增HIV1env基因C2 V3区片段 ,将此扩增产物插入T Vector,酶切鉴定重组质粒 ,使用ABI737自动DNA序列测定仪测定序列并用DNASIS软件进行分析。结果 DNA序列资料显示该毒株属于HIV1B亚型衍生株。但与HIV1B亚型的标准株如SF2株相比 ,该HIV1毒株的env基因V3区下游有 192bp的重复插入突变 ,使得该毒株的膜蛋白PND编码基因呈现双V3区的变异 ,该段DNA序列已登录于GenBank(AF2 2 0 2 45 )。结论 该分离株是