CBP棕榈酰化位点的突变对皮肤鳞状细胞癌A431细胞生物学行为的影响

背景与目的:Src羧基末端激酶结合蛋白(Csk-binding protein,CBP)是新近发现的通过棕榈酰化位点锚定脂筏,参与多种肿瘤的发生、发展过程的抑制性跨膜接头蛋白。本研究旨在观察棕榈酰化位点异常的CBP对皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖及凋亡的影响,并探讨其相关的分子机制。方法:构建CBP-增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)融合蛋白的慢病毒表达载体,采用反转录病毒转染的方法建立CBP棕榈酰化位点突变的A431细胞系以及CBP过表达的A431细胞系,实验分为4组:空白对照组(Parental组,未进行基因转染的A431细胞)、阴性对照组(Control,A431细胞转染仅含EGFP阴性对照病毒载体)、阳性(过表达)对照组(WT-CBP,A431细胞转染WT PAG1-EGFP病毒载体)、实验组(Mutant-CBP,A431细胞转染棕榈酰化位点突变的CBP-EGFP病毒载体)。采用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测转染率,并用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)和蛋白质印迹法(Westernblot)检测转染后细胞中CBP mRNA表达和蛋白水平,验证转染是否成功。采用流式细胞术检测CBP棕榈酰化位点突变对细胞凋亡的影响;细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)细胞增殖实验、划痕、transwell迁移及侵袭实验检测CBP棕榈酰化位点突变对A431细胞生长、迁移和侵袭能力的影响;用Western blot检测Csk和Fyn两种下游信号转导分子蛋白水平的变化。结果:建立了稳定的CBP棕榈酰化位点突变A431细胞系和CBP过表达A431细胞系。采用流式细胞术检测细胞凋亡情况,结果显示,与Control组和Parental组比较WT-CBP组A431细胞的凋亡明显增多,差异有统计学意义(P<0.001);但Mutant-CBP组A431细胞的凋亡与WT-CBP组相比明显减少,与Control组和Parental组比较差异无统计学意义(P>0.05)。划痕实验结果表明,与Control组和Parental组比较野生型CBP过表达组A431细胞愈合率明显降低(P<0.001),而CBP棕榈酰化位点突变A431细胞愈合率没有明显变化(P>0.05)。Transwell迁移和侵袭实验结果表明,与Control组和Parental组比较野生型CBP过表达组A431细胞的迁移、侵袭能力明显降低(P<0.001),过表达CBP棕榈酰化位点突变A431细胞的迁移和侵袭能力与WT-CBP组相比明显增高,而与Control组和Parental组相比差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot结果表明:WT-CBP组Csk和Fyn蛋白与Parental组和Control组相比表达明显增加(P<0.001),而Mutant-CBP组Csk和Fyn蛋白的相对表达水平与Parental组和Control组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:CBP上调可以抑制A431细胞的增殖,但棕榈酰化位点突变的CBP丧失了发挥抑制细胞增殖的功能。由此可见,棕榈酰化位点突变可影响CBP发挥其抑制细胞增殖的作用。

咪喹莫特(imiquimod)联合树突状细胞降低荷黑素瘤小鼠调节性T细胞并增强抗肿瘤效果

目的观察联合应用Toll样受体7(TLR7)激动剂咪喹莫特(imiquimod)和负载肿瘤相关抗原的树突状细胞(DC)疫苗对荷黑素瘤小鼠的治疗作用并探讨相关机制。方法培养表达卵白蛋白的B16黑素瘤(B16-OVA)细胞,注射入C57BL/6小鼠皮下制备荷瘤小鼠模型。含重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rm GM-CSF)和重组小鼠白细胞介素4(rm IL-4)的培养液扩增培养骨髓来源的DC,加入OVA过夜孵育制备负载OVA的DC疫苗(OVA-DC)。荷瘤小鼠分别采用PBS、咪喹莫特局部涂抹、OVA-DC皮内注射、咪喹莫特联合OVA-DC进行治疗,数字游标卡尺测量小鼠皮下肿瘤的生长情况。流式细胞术检测荷瘤小鼠外周血CD4^+FOXP3^+调节性T细胞(Treg)的比例。采用上述方案免疫小鼠后,用CCK-8法检测小鼠脾脏淋巴细胞对B16-OVA细胞的杀伤效应。结果与单纯咪喹莫特、OVA-DC治疗组及PBS对照组相比,咪喹莫特联合OVA-DC治疗组荷瘤小鼠黑素瘤体积较小,荷瘤小鼠CD4^+细胞中FOXP3^+Treg比例明显降低。咪喹莫特联合OVA-DC免疫小鼠脾脏淋巴细胞杀伤B16-OVA肿瘤细胞能力较其他组明显增强。结论咪喹莫特联合负载抗原的DC疫苗可诱导荷瘤机体CD4^+FOXP3^+Treg比例降低并增强抗肿瘤效果。

胃癌患者外周血Th17细胞、血清IL-17、IL-6水平检测及临床意义

目的探讨胃癌患者外周血中Th17细胞与血清中白介素17(IL-17)、白介素6(IL-6)水平的变化及其临床意义。方法选取2017年1~12月青岛大学附属医院收治的40例胃癌患者为观察组,同时选取同期来我院体检的健康者40例作为对照组。采用流式细胞仪检测Th17细胞频率,采用酶联免疫吸附试验(ELISA试验)检测细胞因子IL-17、IL-6的血清浓度。分析Th17细胞频率表达和血清IL-17、IL-6水平与胃癌患者临床特征的关系。结果观察组患者的Th17细胞频率为(1.32±0.23)%,明显高于对照组的(0.79±0.15)%,血清中IL-17和IL-6浓度分别为(11.55±2.45)pg/mL、(199.45±24.42)pg/mL,明显高于对照组的(8.68±1.69)pg/mL、(80.36±14.86)pg/mL,差异均具有统计学意义(P<0.05);胃癌TNM分期不同的患者中,Ⅲ+Ⅳ期患者外周血中Th17细胞频率、IL-17、IL-6的血清浓度分别为(1.42±0.26)%、(13.43±2.17)pg/mL、(217.32±20.66)pg/mL,明显高于Ⅰ+Ⅱ期患者的(1.26±0.20)%、(10.78±2.04)pg/mL、(189.12±19.96)pg/mL,分化程度中低分化患者外周血中Th17细胞频率、IL-17、IL-6的血清浓度分别为(1.43±0.24)%、(13.08±1.99)pg/mL、(210.91±23.72)pg/mL,明显高于中高分化患者的(1.24±0.19)%、(10.17±1.96)pg/mL、(186.06±17.12)pg/mL,有无淋巴结转移患者中有淋巴结转移患者的外周血中Th17细胞频率、IL-17、IL-6的血清浓度分别为(1.45±0.25)%、(14.38±1.32)pg/mL、(223.68±16.06)pg/mL,明显高于无淋巴结转移患者的(1.25±0.19)%、(10.52±1.80)pg/mL、(187.56±17.23)pg/mL,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论外周血中Th17细胞频率、IL-17、IL-6水平在胃癌患者中的表达明显增高,Th17细胞及其细胞因子可能与胃癌密切相关。

Th17细胞相关因子IL-17、IL-6、TGF-β及CRP在妊娠期糖尿病的作用研究

目的:检测妊娠期糖尿病(GDM)患者外周血Th17细胞相关因子及CRP的表达水平,探讨Th17细胞相关因子介尊的炎症在GDM发病机制中的作用.方法:选取GDM患者35例(GDM组),正常孕妇组50例,及健康未孕女性组40例(健康对照组),检测Th17细胞相关因子IL-17、IL-6、TGF-β、CRP及胰岛素在外周血中的水平,并分析上述细胞因子在胰岛素抵抗中的相关性.结果:与健康对照组相比较,GDM组、正常孕妇组IL-6、IL-17、TGF-β上升,差异有统计学意义(P<0.05);GDM组与健康对照组及正常孕妇组比较,CRP、IL-17 上升更明显(P<0.05);GDM组与正常孕妇组比较TGF-β表达下调,与NGT组比较差异无统计学意义;相关性分析显示,CRP与1L-17呈正相关,与TGF-β呈负相关.结论:Th17细胞相关因子ILT7、IL-6、TGF-β在孕晩期表达上调,造成体内的持续炎症,参与胰岛素抵抗的发生,TGF-β在GDM中以调控免疫细胞分化因子的作用抑制GDM炎症的发展.

肝素结合蛋白在鉴别诊断类风湿性关节炎合并细菌感染患者中的临床价值

目的探讨血浆肝素结合蛋白(HBP)在类风湿性关节炎(RA)合并细菌感染患者中的诊断价值和临床意义。方法纳入RA患者122例、单纯细菌感染患者23例、同期健康体检者60例作为研究对象,其中RA合并细菌感染组42例,RA活动期组39例,RA缓解期组41例。应用透射免疫比浊法测定研究对象静脉血HBP浓度,评估其与白细胞(WBC)、红细胞沉降速率(ESR)、C反应蛋白(CRP)的相关性。不同组间比较采用Kruskal-Wallis H检验,使用Spearman做连续变量相关性分析,绘制受试者工作特征曲线(ROC),评估HBP鉴别诊断RA患者合并细菌感染的敏感性和特异性。结果RA合并细菌感染组HBP为63.30(36.83~123.00)ng/mL,高于RA活动期组17.00(14.00~21.60)ng/mL(P<0.01),高于RA缓解期组8.30(6.65~9.60)ng/mL(P<0.01)和健康对照组7.40(5.63~8.80)ng/mL(P<0.01),与单纯细菌感染组68.70(42.10~100.60)ng/mL比较差异无统计学意义(P>0.05);RA活动期组高于RA缓解期组(P<0.01)和健康对照组(P<0.01);RA缓解期组和健康对照组无统计学差异(P>0.05)。RA合并细菌感染组HBP水平与CRP呈正相关(r=0.332,P<0.05),RA活动期组HBP水平与CRP、疾病活动度(DAS28)呈正相关(r=0.582,P<0.01;r=0.461,P<0.05),两组HBP水平与WBC、ESR均无相关性(P>0.05)。ROC曲线显示当HBP水平为24.55 ng/mL时,是诊断RA患者合并细菌感染的最佳阈值,其敏感性为92.9%,特异性为84.6%。结论HBP是可用于RA合并细菌感染和活动期鉴别诊断的敏感且特异的指标。

胰岛素强化治疗对初诊2型糖尿病胰岛β细胞功能的影响与临床分析

目的分析胰岛素强化治疗对于初诊2型糖尿病患者的胰岛素β细胞的影响情况。方法将2017年1~7月收治的78例初诊2型糖尿病患者,根据患者是否具有家族史分为家族史组48例以及无家族史组30例,另选择同期到医院接受健康体检的健康人群40例,其中根据患者是否具有家属遗传病分为,家族史正常对照组10例,无家族史正常对照组30例。2型糖尿病的患者采取胰岛素强化治疗,正常人群采取精氨酸刺激实验评估对照组的β细胞功能。比较不同人群β细胞的功能情况以及空腹血清白细胞介素-6(IL-6),白细胞介素-8(IL-8)及肿瘤坏死因子(TNFα)的浓度。结果正常对照组人群的β细胞功能无差异,糖尿病患者中,不同时间点存在差异;患者的胰岛β细胞均改善,无家族史改善情况优于家族史患者。正常人均中的IL-6,IL-8,TNFα均无差异,家族史患者体内IL-6,IL-8,TNFα水平高于无家族史,但差异不显著。结论胰岛素强化治疗对于初诊2型糖尿病患者可以明显的改善患者的β细胞功能状态,控制患者病情,提高患者生活质量。

血清IL-6和YKL40的联合检测对卵巢癌早期诊断的应用研究

目的:本研究通过检测IL-6、YKL40在卵巢癌患者血清中的水平变化,探讨IL-6、YKL40在卵巢癌诊断中的意义。方法:收集健康对照者血清标本20例,卵巢良性肿瘤患者血清标本20例,卵巢癌患者血清标本36例,ELISA法检测各组血清中IL-6、YKL40表达水平。结果:与对照组相比,IL-6和YKL40在卵巢癌患者血清中高表达,且高于良性肿瘤组;联合检测两指标比单一检测阳性率高。结论:血清中IL-6、YKL40在卵巢癌中高表达,两指标联合检测提高了癌症检测灵敏度。

甲巯咪唑对初诊Graves’病患者血清相关细胞因子及microRNAs水平的影响

目的探讨甲巯咪唑对初诊Graves’病患者血清相关细胞因子及microRNAs(miRNAs)水平的影响。方法选取2016年12月~2019年1月于海阳市人民医院内分泌科就诊的36例Graves’病初诊患者为疾病组,给予甲巯咪唑治疗。另选取同期30例健康志愿者作为健康对照组。比较疾病组治疗前、治疗后及健康对照组甲状腺功能指标[游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)、促甲状腺激素(TSH)、促甲状腺激素受体抗体(TRAb)]、细胞因子[IL-2、IL-6、IL-17、TGF-β1]、hs-CRP、microRNAs[miR-16、miR-142-3p、miR-146a、miR-155]的水平。结果疾病组治疗前FT3、FT4,TRAb,IL-6、IL-17、TGF-β1、hs-CRP,miR-16、miR-142-3p、miR-155水平高于健康对照组,TSH、IL-2及miR-146a水平低于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。疾病组治疗后FT3、FT4、TRAb、IL-6、TGF-β1、hs-CRP、miR-16、miR-142-3p、miR-155水平低于治疗前,而TSH、IL-2、miR-146a水平高于治疗前,差异有统计学意义(P<0.05);IL-17水平治疗前后比较,差异无统计学意义(P>0.05)。疾病组治疗后TSH、IL-2、miR-146a水平低于健康对照组,IL-6、IL-17、TGF-β1、hs-CRP、miR-16、miR-155水平高于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05),两组FT3、FT4、TRAb及miR-142-3p水平比较,差异无统计学意义表(P>0.05)。结论甲巯咪唑可改善Graves’病患者的甲状腺功能,血清相关细胞因子及miRNAs可作为该病临床诊疗的辅助指标。

冠状动脉粥样硬化患者外周血Th17细胞与IL-17的水平及意义

目的探究冠状动脉粥样硬化患者外周血Th17细胞与IL-17水平变化的意义。方法收集青岛阜外心血管病医院冠状动脉粥样硬化患者200例,根据疾病类型分为心肌梗死(AMI)组(52例)、不稳定型心绞痛(UA)组(68例)、稳定型心绞痛(SA)组(80例),另外选取同期200例体检者作为对照组。采用流式细胞术检测患者Th17细胞频率,ELISA法检测各组血清中IL-17、CRP表达水平。结果流式细胞检测结果显示,与对照组比较,各组Th17细胞的频率表达均升高,差异具有统计学意义(P<0.05),且AMI组升高水平高于SA组和UA组,差异具有统计学意义(P<0.05);ELISA检测结果显示,与对照组比较,各组IL-17及CRP表达水平均升高,差异具有统计学意义(P<0.05),且AMI组升高水平高于SA组和UA组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论冠状动脉粥样硬化患者血中Th17及IL-17水平的升高,可能是导致冠状动脉粥样硬化患者板块不稳定的原因。