青岛市HLA-B27基因亚型与强直性脊柱炎相关性研究

目的探讨HLA-B27基因亚型与强直性脊柱炎的相关性。方法采用酵素免疫法检测HLA-B27,并进一步采用聚合酶链反应一序列特异性引物法进行HLA-B27基因亚型分型。结果强直性脊柱炎HLA-B27检出率为94%,显著高于正常对照组,基因分型B*2705分布最广(57.5%),其次是B*2704(40.4%)。结论HLA-B27与AS具有明显的相关性,检测B*2705和B*2704,亚型对于AS的辅助诊断具有重要意义。

沙蚕消化道产蛋白酶菌D2株的筛选及其酶学性质

目的从海洋生物双齿围沙蚕消化道筛选产蛋白酶菌株,并对其胞外蛋白酶的性质进行分析。方法用脱脂奶粉平板溶圈法及改良Lowry法进行产蛋白酶菌株的筛选和蛋白酶活力测定;Bradford法测定蛋白含量;UVP GDS8000型凝胶成像系统和VisionWorks、Bandscan4·03软件进行相对分子质量和纯度分析,并对酶的各项性质进行检测。结果筛选出高蛋白水解活性菌株D2,其胞外蛋白酶比活性为156·0U/mg,相对分子质量约为42000,纯度大于97%,最适作用温度60℃,最适pH为9,在pH6～10及0～55℃具有较好的稳定性。结论D2株分泌的胞外蛋白酶有望成为一种新型的海洋微生物蛋白酶资源。

沙蚕消化道细菌D2胞外蛋白酶的分离纯化及其性质

目的分离纯化沙蚕消化道菌D2胞外蛋白酶,并对其性质进行分析。方法收集48 h发酵液上清,经80%饱和硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose阴离子交换层析、Superdex G-75凝胶过滤层析逐步纯化D2蛋白酶,分析其酶学性质,并用ESI-MS/MS测定其酶解后的部分氨基酸序列。结果经纯化,得到电泳纯的D2蛋白酶,纯化倍数为4.9倍,活性回收率为33%,相对分子质量约42 000,纯度大于99%;最适作用温度为60℃,最适pH为9,在pH6-11及0-60℃具有较好的稳定性,水解酪蛋白的Km值为2.44 mg/ml;Cu2＋、Ca2＋、Mg2＋、K＋等金属离子对酶活力有明显促进作用,EDTA和PMSF对酶活力有强烈抑制作用;该酶对尿素、SDS、DTT等变性剂有较好的耐受性,其两个内部肽段经质谱测序,序列分别为AHGFLPLTK和APSATG-GSALYPLEFVVGK。结论该酶为一高温碱性丝氨酸蛋白酶,具有较高的工业开发价值和较大的应用潜力。

AST/ALT、HBeAg与单纯HBV感染疾病的关系

目的研究谷草/谷丙转氨酶比值(AST/ALT)、乙型肝炎e抗原(HbeAg)与慢性乙型肝炎、肝炎后肝硬化、原发性肝癌的关系及临床意义。方法AST、ALT由贝克曼生化仪采用速率法检测,HBeAg由西班牙班珀斯变色龙全自动酶免分析仪采用ELISA方法检测。结果①肝炎后肝硬化的AST/ALT比值(1.67±0.72)与原发性肝癌组的(2.07±1.46)均高于慢性乙型肝炎组(0.84±0.46)(P<0.01);肝炎后肝硬化的HBeAg阳性率(16/49)与原发性肝癌组的(10/50)均低于慢性乙型肝炎组(30/51)(P<0.05,P<0.01);②慢性乙型肝炎组与肝炎后肝硬化组各组内HBeAg阳性的AST/ALT比值与HBeAg阴性的AST/ALT比值比较,无统计学意义(P>0.05)。结论随着HBV感染后疾病的进展,AST/ALT比值升高,HBeAg阳性率降低,提示肝细胞的破坏加剧可能与机体自身免疫功能有很大关系。

表达谷胱甘肽S转移酶-蜂毒素-^(88)精氨酸变体白细胞介素2工程菌的发酵条件研究

目的研究重组蜂毒素-88精氨酸变体白细胞介素2(Melittin-88ArgIL-2)工程菌的发酵条件。方法采用摇瓶发酵,对含pGEX-4T-2-Melittin-88ArgIL-2重组质粒的工程菌进行诱导表达,研究诱导温度、诱导时间、诱导剂浓度、培养基的pH值等对谷胱甘肽S转移酶-Melittin-88ArgIL-2表达量的影响。同时研究培养温度对产物表达形式的影响。结果根据优化的条件,蛋白质的表达量占菌体总蛋白质的36%左右。结论确立了该重组melittin-88ArgIL-2工程菌的发酵条件。

蜂毒肽与变构hIL-2融合基因原核表达载体的构建

目的构建蜂毒肽与人变构白细胞介素-2原核表达载体，为进一步研究该融合基因而奠定基础。方法以本室构建质粒pGEX-4T-2／Melittin-IL-2（^88Arg）为模板，设计引物，用PCR定点突变的方法将IL-2部分的^125Cys突变为Ala，PCR产物与pMD18-T连接，转化大肠杆菌，小提质粒，DNA测序后再将目的片段连接于pET-15b，最后酶切鉴定。结果PCR产物542bp，构建质粒双酶切、DNA测序鉴定如预期。结论成功构建蜂毒肽与人变构白细胞介素-2原核表达载体。

沙蚕消化道D2菌株胞外蛋白酶对EMT6细胞增殖的影响

目的研究沙蚕消化道产蛋白酶菌D2株胞外蛋白酶对鼠乳腺癌细胞EMT6增殖的影响。方法选用鼠乳腺癌细胞EMT6作为靶细胞，用0．0043-43μmol／L浓度的沙蚕消化道产蛋白酶菌D2株胞外蛋白酶（D2蛋白酶），通过体外细胞培养法进行细胞增殖抑制检测，测其吸光度（OD）值，计算细胞增殖抑制率，与阳性对照组（紫杉醇组）比较。结果实验组OD值低于空白对照组，且存在时间和剂量依赖关系。结论沙蚕消化道产蛋白酶菌D2株胞外蛋白酶对鼠乳腺癌细胞EMT6的增殖存在抑制作用，显示出一定的抗肿瘤活性。

蜂毒肽与变构hIL－2融合基因原核表达载体的构建

目的构建蜂毒肽与人变构白细胞介素－2原核表达载体，为进一步研究该融合基因而奠定基础。方法以本室构建质粒pGEX－4T-2／Melittin－IL－2（^88Arg）为模板，设计引物，用PCR定点突变的方法将IL-2部分的^125Cys突变为Ala，PCR产物与pMD18-T连接，转化大肠杆菌，小提质粒，DNA测序后再将目的片段连接于pET-15b，最后酶切鉴定。结果PCR产物542bp，构建质粒双酶切、DNA测序鉴定如预期。结论成功构建蜂毒肽与人变构白细胞介素-2原核表达载体。

汉滩病毒截短S基因重组梭菌载体构建及表达

目的:构建含汉滩病毒截短核蛋白基因的重组质粒,并在口服疫苗载体产气荚膜梭菌中表达。方法:以质粒pGEX-4T-2/SA为模板,PCR扩增汉坦病毒截短核蛋白(SA)基因片断,克隆入穿梭载体pJRC200,构建重组质粒pJRC200-SA,转化E.coliDH5α,酶切鉴定。将pJRC200-SA电穿孔转化产气荚膜梭菌,厌氧培养,促芽孢形成诱导蛋白表达。超声裂解产气荚膜梭菌芽孢,对裂解产物进行SDS-PAGE、Western blotting鉴定。结果:酶切、测序表明,SA基因片段被正确插入pJRC200中,Western blotting分析显示SA蛋白成功表达,并能被肾综合征出血热患者阳性血清特异性识别。结论:汉坦病毒截短核蛋白重组克隆构建成功,并能在产气荚膜梭菌中成功表达,为口服疫苗研发奠定了基础。

初发SLE病人CRP变化与动脉粥样硬化形成关系

目的探讨初发系统性红斑狼疮（SLE）病人C-反应蛋白（CRP）水平与病情活动性及动脉粥样硬化形成的关系。方法选取58例初发、未经治疗的SLE病人,以同期58例年龄、性别与之相匹配的健康人作对照。根据SLE病人的疾病活动指数（SLEDAI）将SLE病人分为活动组30例,非活动组28例。以常规方法检测SLE病人和对照组血清CRP、纤维蛋白原（Fg）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的浓度,以高频超声测量颈总动脉内膜中层厚度（IMT）,分析CRP变化与SLE动脉粥样硬化形成的关系。结果SLE病人活动组CRP、Fg水平及IMT高于非活动组及对照组,差异有显著性（F=34.262~177.932,q=8.631~25.944,P〈0.01）;SLE病人活动组LDL-C水平明显高于非活动组和对照组,HDL-C水平低于非活动组及对照组,且非活动组与对照组比较差异也有显著性（F=24.828、23.335,q=2.834~9.653,P〈0.05、0.01）。活动组CRP水平与SLEDAI及IMT呈正相关（r=0.76、0.85,P〈0.01）。结论SLE病人存在明显的炎症反应,CRP可作为SLE病人病情活动性的一个较好预测指标,CRP水平与SLE病人动脉粥样硬化的发生有明显的相关性。

沙蚕消化道D2菌株胞外蛋白酶对EMT6细胞增殖的影响

目的研究沙蚕消化道产蛋白酶菌D2株胞外蛋白酶对鼠乳腺癌细胞EMT6增殖的影响。方法选用鼠乳腺癌细胞EMT6作为靶细胞，用0．0043～43μmol／L浓度的沙蚕消化道产蛋白酶菌D2株胞外蛋白酶（D2蛋白酶），通过体外细胞培养法进行细胞增殖抑制检测，测其吸光度（OD）值，计算细胞增殖抑制率，与阳性对照组（紫杉醇组）比较。结果实验组OD值低于空白对照组，且存在时间和剂量依赖关系。结论沙蚕消化道产蛋白酶菌D2株胞外蛋白酶对鼠乳腺癌细胞EMT6的增殖存在抑制作用，显示出一定的抗肿瘤活性。

狂犬病毒核蛋白在大肠杆菌中的克隆及高效表达

目的构建原核表达系统对狂犬病毒（RV）CVS株的核蛋白（NP）进行表达，并对其进行初步的血清学鉴定。方法以重组质粒Teasy—RVNP为模板，利用PCR方法扩增狂犬病毒（RV）CVS株核蛋白（NP）的DNA片段，并重组入原核高效表达载体PET-15b。用酶切电泳验证重组结果的正确性；并通过测序检查质粒重组后序列有无变化。在大肠杆菌BL21中进行表达。结果SDS-PAGE电泳结果表明，在51KDa处有一条蛋白表达带Western-blot分析证明，51KDa蛋白带可与抗体血清发生特异性反应。结论成功构建了PET-15b，NP原核表达载体，表达产物为狂犬病毒核蛋白，为生产纯度高且价廉的RVNP抗原奠定了基础。为制备测定RVNP抗体的免疫诊断试剂提供了条件。

HLA-B27基因亚型检测与强直性脊柱炎相关性研究

目的探讨HLA-B27基因亚型与强直性脊柱炎的相关性。方法采用酵素免疫法检测HLA-B27，并进一步采用聚合酶链反应序列特异性引物法进行HLA-B27基因亚型分型。结果强直性脊柱炎HLA-B27检出率为95％，显著高于正常对照组，基因分型B2705分布最广（59.3％），其次是B2704（38．9％）。结论HLA-B27与AS具有明显的相关性，检测B2705和B2704亚型对于AS的辅助诊断具有重要意义。

D2蛋白酶间接ELISA检测方法的建立

目的建立D2蛋白酶间接ELISA检测方法,为D2蛋白酶的进一步研究及应用奠定基础。方法以纯化的D2蛋白酶为抗原,免疫新西兰白兔,制备D2蛋白酶多克隆抗体,建立D2蛋白酶间接ELISA检测方法,并进行验证及初步应用。结果D2蛋白酶间接ELISA检测方法的最佳反应条件为:一抗稀释度为1∶64000,二抗稀释度为1∶80000,抗原稀释度为1∶100,饱和包被浓度为1160ng/ml,封闭剂为10%胎牛血清。标准曲线的线性检测范围为18～1160ng/ml。该方法准确性、重复性良好,特异性强、敏感性高,与琼脂扩散试验检测结果的符合率为95.5%。结论已建立了D2蛋白酶间接ELISA检测方法,可用于D2蛋白酶含量的检测。