克隆人血小板源性生长因子B基因构建腺相关病毒载体及其病毒滴度测定

目的:克隆人血小板源性生长因子B基因于腺相关病毒载体中,以获得高感染滴度的重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒。方法:实验于2005-10/2006-11在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。①健康足月产妇胎盘组织由青岛大学医学院附属医院妇产科提供,产妇及其家属均知情同意。DH5α宿主菌由青岛大学医学院附属医院中心实验室制备保存。②Trizol试剂提取健康足月产妇胎盘组织总RNA,反转录-聚合酶链反应一步法克隆人血小板源性生长因子B基因全长开放读框。聚合酶链反应产物定向克隆于腺相关病毒载体,重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体进行双酶切和测序鉴定。③采用磷酸钙转染法将重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体、腺相关病毒包装载体,腺相关病毒辅助载体共转染腺相关病毒293细胞,包装得到重组腺相关病毒并回收病毒原液,显微镜下观察细胞及培养基的变化。④以携带β-半乳糖苷酶基因的腺相关病毒作为报告基因同重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体一样共转染相关病毒293细胞,对报告基因行X-Gal染色,通过蓝染的细胞计算病毒滴度。结果:①重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体酶切鉴定及序列分析:聚合酶链反应产物经电泳证明大小正确,重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒载体酶经双酶切和测序鉴定证实将血小板源性生长因子B基因正确插入。②腺相关病毒293细胞转染过程中病毒颗粒的产生:腺相关病毒293细胞转染6h后培养基底部出现无数小黑色颗粒,为加入的转染复合物颗粒。24h后腺相关病毒293细胞部分变圆,随着病毒增殖,细胞成串浮起,出现细胞病理效应。48h后细胞变形,逐渐从壁上脱落。72h后培养基的颜色从红色变化为橙色或黄色。③病毒滴度检测:通过携带β-半乳糖苷酶基因的腺相关病毒感染细胞后X-gal染色计数,测定重组腺相关病毒滴度为1×1010 L-1。结论:成功构建表达人血小板源性生长因子B基因的重组腺相关病毒载体,为进一步研究血小板源性生长因子B基因治疗角膜病和相关细胞系与组织的增殖提供实验基础。

乙肝血清学阳性产妇乳汁中HBV-DNA检测的意义

我国是乙型病毒性肝炎高发地区,哺乳是乙肝病毒母婴传播的途径之一,也是引起婴儿感染的重要因素。因此,乙肝病毒携带产妇产后能否母乳喂养日益受重视。笔者应用荧光定量PCR方法对在所在医院分娩的42例乙肝病毒血清学标志物（HBVM）阳性产妇及5例HBVM全阴性产妇的乳汁行HBV—DNA检测．以探讨乳汁HBV—DNA检测对安全哺乳的指导意义。

人血小板源性生长因子B基因转染对猫角膜内皮细胞增殖的影响

背景：许多研究显示外源性的人血小板源性生长B基因的转染可促进创伤的愈合。目的：用重组人血小板源性生长因子B基因真核表达载体及重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒转染和感染猫角膜内皮细胞，观察其对猫角膜内皮细胞增殖的影响。设计、时间及地点：分组对照观察细胞基因工程研究，于2007—01／11在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。材料：健康足月幼猫，体质量250-300g，雌雄不限。重组人血小板源性生长因子B基因真核表达载体及重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒由青岛大学医学院附属医院中心实验室自行构建。方法：常规显微镜下撕取内皮培养法，培养出原代猫角膜内皮细胞，传2代的细胞用于实验。脂质体法将重组人血小板源性生长因子B基因真核表达载体转染到猫角膜内皮细胞中，重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒采用直接感染法。实验分正常对照组、质粒对照组、重组质粒组、腺相关病毒对照组和重组腺相关病毒组。转基因24h和48h后收集细胞，Trizol试剂提取其总RNA。主要观察指标：通过荧光定量聚合酶链反应检测目的基因在细胞中的表达。四甲基偶氮唑盐法检测转基因48h后细胞的增殖活性。结果：①撕取内皮法可方便获取到原代猫角膜内皮细胞。②自行设计的针对目的基因及内参基因的探针引物经扩增后电泳验证及序列测定证明特异性高。③转基因24h和48h后荧光定量聚合酶链反应检测人血小板源性生长因子B基因mRNA发现：正常对照组、真核表达质粒对照组和腺相关病毒对照组间差异无显著性意义（P〉0．05）；重组人血小板源性生长因子B基因真核表达质粒转染组和重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒实验组与正常对照组相比差异显著（P〈0．05）。④四甲基偶氮唑盐法检测显示重组质粒转染和重组病毒感染均可促进细胞增殖，真核表达质粒对照组和腺相关病毒对照组与正常对照组相比差异无显著性意义（P〉0．05）。结论：重组人血小板源性生长因子B基因真核表达载体及重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒可在角膜内皮细胞中高效表达并具有促进细胞增殖的活性。

螺旋CT灌注成像评估直肠癌血管生成状态的研究

目的探讨螺旋CT灌注成像对直肠癌血管生成状态评估的价值。方法对30例直肠癌患者进行螺旋CT灌注成像检查。选定肿瘤平面后进行同平面两层动态增强扫描，绘制所选层面的癌灶、靶动脉的感兴趣区的时间-密度曲线（TDC）。根据TDC计算出病灶的血流灌注量（BF）、血容量（BV）、平均弥散时间（MTT）、表面弥散性（PS）。术后选择对应扫描平面标本癌组织4μm切片进行免疫组织化学染色（SP），经鼠抗人CD34单克隆抗体标记肿瘤组织内血管内皮细胞，测定癌组织微血管密度（Microvessel Density MVD）。结果MVD、BF、MTT在PTNM不同分期、不同浸润深度、有无淋巴结转移比较中差异有统计学意义（P〈0．01）；MVD、BF随着病理分期的增高呈升高趋势，两者呈显著正相关（r=0．723，P〈0．01）；MTT随病理分期的增加而缩短，与MVD呈显著负相关（r=-0．656，P〈0．01）。BV随分期增加、浸润深度增加、淋巴结转移呈增高趋势，但无统计学意义（P〉0．05）；PS随分期增加有下降趋势，但差异无统计学意义（P〉0．05）。结论直肠癌的MVD与血流灌注量之间呈正相关、与平均弥散时间呈负相关；螺旋CT灌注成像能从活体较好地反映肿瘤的微循环功能，可提供非侵入性监测肿瘤血管生成状态的方法。

RhoA、RhoC基因在结直肠癌组织中的表达及其意义

目的检测RhoA和RhocmRNA在结直肠癌组织中的表达，并探讨其表达在结直肠癌发生、发展和侵袭转移中的意义。方法TaqMan探针法进行实时荧光定量聚合酶链反应，检测RhoA和RhoCmRNA在正常黏膜组织、癌旁组织及结直肠癌组织中的相对表达，探讨与临床病理学指标的关系。结果38例结直肠癌组织中RhoA和RhoCmRNA平均相对表达水平为正常黏膜组织的4．516和3．832倍，差异有统计学意义（P〈0．05）。RhoA、RhoC mRNA的表达均与有无淋巴结转移、有无肝转移有关（P〈0．05）。RhoA mRNA的表达与组织学类型有关，RhoC mRNA的表达与肠壁浸润深度有关（P〈0．05）。结论RhoA和RhoC mRNA的表达在结直肠腺癌组织中明显增高，RhoA和RhoC与结直肠癌发生、发展和侵袭转移密切相关。

RhoA、RhoC串联RNA干扰载体的构建及在结直肠癌细胞中的表达

目的探讨RhoA、RhoC串联RNA干扰载体的构建及在结直肠癌细胞中的表达。方法设计合成4对靶向RhoA与RhoC基因的各两对寡核苷酸序列，退火后分别克隆人shRNA表达载体；通过一系列的酶切与连接，将该4段干扰片段串联起来，构建一个同时表达4个shRNA的重组质粒。经酶切和测序鉴定重组质粒。脂质体法转染HCTll6，荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）检测各细胞中RhoA、RhoCmRNA的表达，噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞的增殖活性。结果经酶切和测序证实重组质粒pGenesil2．7-A1＋A2＋C1＋C2构建成功。转染该重组质粒后细胞中RhoA、RhoCmRNA的表达水平分别为（0．78±0．11）和（0．90±0．21），明显低于空白对照组（0±0．15、0±0．09）和阴性对照组（一0．05±0．12、0．11±0．10，P〈0．05），且细胞的生长增殖率（63．8±12．5）％也显著低于对照组和质粒对照组（101．6±13．7）％（P〈0．05）。结论成功构建4个shRNA串联的重组表达载体，该载体可在体外高效表达。