利用废弃胚胎进行体外受精实验室质控的可行性探讨

目的探讨废弃胚胎作为体外受精(IVF)实验室质控的可行性。方法通过囊胚序贯培养将无原核(0PN)、单原核(1PN)、3原核(3PN)和发育迟缓或停滞的2原核(2PN)的废弃胚胎进行囊胚培养,比较不同来源胚胎的囊胚形成情况。结果共收集396个废弃胚胎,经序贯培养形成98个囊胚(24.75%),0PN、2PN、1PN、3PN的囊胚形成率分别为50.50%(51/101)、24.59%(30/122)、1 7.07%(7/41)、7.58%(10/132),其中0PN、停滞的2PN的胚胎有孵出,孵出率分别为47.06%(24/51)和33.33%(10/30);有囊胚形成与无囊胚形成患者的临床妊娠率分别为30.28%(43/142)、1 9.72%(28/142),两者相比有统计学差异(P<0.05);特别是0PN+2PN患者的临床妊娠率为23.24%(33/142),显著高于无囊胚形成者的9.15%(13/142)(P<0.01)。结论废弃胚胎有不同程度的发育潜能,可部分发育成囊胚,特别是0PN+2PN囊胚形成率超过35%,可以作为IVF实验室质控的一种辅助方法,并可作为临床妊娠结局预测的参考指标。

实时荧光定量PCR技术在医学诊断中的应用

实时荧光定量PCR是近年来发明的一种核酸检测技术，因高精确度、高灵敏性、污染少等优点已在生物医学基础科研及医学临床中得到广泛应用，本文就该技术在医学诊断方面的应用作简要综述。

半乳糖凝集素3对内皮细胞生长、迁移及炎症反应的影响

目的:探讨半乳糖凝集素3(GAL-3)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)生长、迁移及炎症反应的影响及其作用机制。方法:体外培养HUVECs,给予GAL-3重组蛋白2 mg/L或GAL-3短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体处理,实验分为正常对照组、GAL-3重组蛋白处理组、阴性对照组和GAL-3-shRNA组。通过实时荧光定量PCR检测GAL-3、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、IL-6、基质金属蛋白酶9(MMP-9)和cyclin D1的mRNA水平;利用Western blot检测GAL-3、MCP-1和IL-6的蛋白表达;利用ELISA检测MCP-1和IL-6在培养基中的水平;通过CCK-8实验和划痕实验检测HUVECs的活力和迁移能力;利用Western blot检测信号分子热休克蛋白90(HSP90)、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK和p-JNK的蛋白水平。结果:首先,给予GAL-3重组蛋白处理后,GAL-3、MCP-1和IL-6的mRNA及蛋白水平,MMP-9和cyclin D1的mRNA水平,MCP-1和IL-6在培养基的分泌水平均明显高于正常对照组;而GAL-3-shRNA感染细胞后,上述分子的表达水平均低于正常对照组和阴性对照组。其次,GAL-3重组蛋白处理后,细胞活力和迁移能力明显高于正常对照组;而GAL-3-shRNA感染后,细胞活力和迁移能力均低于正常对照组和阴性对照组。此外,GAL-3重组蛋白处理组中,p-ERK1/2和HSP90的蛋白水平高于正常对照组;而GAL-3-shRNA组中,p-ERK1/2和HSP90的蛋白水平均低于正常对照组和阴性对照组。p-JNK的蛋白水平在各组间比较,差异无统计学显著性。结论:GAL-3促进血管内皮细胞的生长、迁移及炎症反应的发生,其机制可能与HSP90-ERK1/2信号通路有关。

成纤维细胞生长因子21对内质网应激诱导心肌细胞凋亡的影响及其机制研究

目的:探讨成纤维细胞生长因子21(FGF21)在内质网应激(ERS)诱导心肌细胞凋亡中的保护作用及其作用机制。方法:以pc DNA4为基因载体,构建pc DNA4-FGF21质粒并转染H9c2大鼠心肌细胞48h,加入衣霉素(TM)10μM处理24h构建内质网应激模型,实验分为4个组:对照组、衣霉素处理组、pcDNA4-FGF21+衣霉素组、pcDNA4+衣霉素组。利用蛋白免疫印迹(Western blot)方法检测FGF21蛋白及蛋白激酶R样ER激酶(PERK)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)介导的凋亡通路相关蛋白的表达。利用CCK8检测细胞存活率和TUNEL检测细胞凋亡率。结果:成功构建pcDNA4-FGF21质粒并在H9c2细胞中过表达。与对照组相比,衣霉素处理组和pcDNA4+衣霉素组明显上调H9c2细胞内源性FGF21的表达(P<0.01),以及增加PERK和JNK介导的凋亡通路相关蛋白的表达(P<0.05~0.01),减少细胞存活率和提高细胞凋亡水平(P<0.05~0.01)。与衣霉素处理组和pcDNA4+衣霉素组相比,在pcDNA4-FGF21+衣霉素组明显降低PERK和JNK介导的凋亡通路相关蛋白的表达,增加细胞存活率,降低细胞凋亡水平(P<0.05~0.01)。结论:FGF21过表达可以减轻内质网应激诱导心肌细胞的凋亡,其机制可能部分与抑制内质网应激中PERK和JNK介导促凋亡通路的信号传导有关。

白斑综合征中国对虾肝胰腺蛋白质组学研究的技术探索

建立白斑综合征中国对虾肝胰腺蛋白质组学技术体系，以惠白斑综合征中国对虾的肝胰腺为研究对象，健康中国对虾肝胰腺为对照组，探索2种蛋白质组学差异蛋白的分离和鉴定的方法。采用双向凝胶电泳（4～7固相pH梯度干胶条，10％SDS-PAGE）分离蛋白质组，银染显色，图像分析软件比较分析，识别差异蛋白，胶上扣点，处理后通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MOLDI-TOF）得到肽质量指纹图谱，软件分析后应用Mascot数据库搜索软件鉴定蛋白。分别获得中国对虾患白斑病组及对照组正常肝胰腺蛋白质组表达图谱，分别识别出203和107个蛋白质点，筛选并尝试鉴定数个差异蛋白。对各方法步骤进行了技术探讨，对实验过程提出了一系列建议，建立了双向电泳及生物质谱方法研究中国对虾白斑病的蛋白质组学技术体系，该体系拓宽了对虾免疫生理研究的途径，以从蛋白质水平探讨对虾发病机制，寻找有效药物靶点。

Livin在后发性白内障动物模型中的表达

目的:建立新西兰大白兔后发性白内障(posterior capsule opacification,PCO)动物模型,检测凋亡抑制因子Livin在PCO中的表达,从而探讨Livin在PCO形成过程中的作用。方法:选用健康新西兰大白兔30只,随机分为实验组(25只),分为A,B,C,D,E组,对照组(5只),实验组行右眼晶状体皮质吸出,分别于术后即刻;3,7,14,28d(每个时间点5只)对术眼行裂隙灯显微镜检查,并处死动物获取术眼晶状体后囊膜,对照组直接处死动物获取右眼后囊膜,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western-blotting方法检测Livin在正常对照组及术后不同时间点PCO中的表达。结果:RT-PCR和Western-blotting在正常对照组及术后即刻A组均未检测到Livin的表达,实验组B,C,D,E术后不同时段的PCO组织中均可检测到不同程度Livin的表达,其中RT-PCR和Western-blotting均显示术后C组Livin表达较为明显,D组表达开始下降,但至E组仍有表达,B组表达最低。结论:Livin的表达在PCO的形成过程中具有相应的时相性,为进一步探索PCO的基因治疗提供了理论依据。

大鼠附睾蛋白质组的提取和二维液相色谱分离

背景与目的:提取大鼠附睾液蛋白并建立一种利用二维液相色谱法分离附睾蛋白组的方法。方法:分离提取大鼠附睾液蛋白,样品利用起始缓冲液置换后,进行一维色谱聚焦分离,然后收集pH8.5-4.0之间的组份进行二维反相高压液相色谱分离,最后将获得的二维UV图通过ProteoVue软件转换成PI/UV图谱。结果:成功提取了附睾液蛋白,并通过二维液相色谱成功建立了大鼠头体尾部附睾液蛋白的二维PI/UV图谱,收集了一维色谱聚焦分离的pH8.5-4.0区间的20个组份,并将每个组份进行二维色谱分离后转换为PI/UV图谱。结论:为进一步全面研究附睾蛋白功能和体液差异蛋白质组研究打下了基础。

人线粒体DNA荧光定量PCR检测方法的建立

建立SYBR Green I实时荧光PCR定量检测人线粒体DNA的方法。选取人线粒体DNA高度保守基因片段,将该基因片段与pCF-T载体连接后,转化入E.coli DH5α,提取重组质粒PCR及测序鉴定后,作为阳性模板建立SYBR-Green I荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线。结果表明:构建的标准曲线线性关系良好(反应体系中含101~108拷贝时,扩增反应CT值与拷贝数的对数成线性关系),相关系数为0.997。批内和批间重复性测定的变异系数分别为1.23%~3.29%以及3.10%~5.21%。我们成功建立了实时荧光定量PCR检测人线粒体DNA的方法,该方法可作为进一步研究线粒体DNA的方法,在相关疾病诊断和监测中具有一定的应用前景。

内质网应激对心肌细胞FGF21及其受体表达的影响和机制研究

目的探讨内质网应激(ERS)对心肌细胞成纤维细胞生长因子21(FGF21)及其主要受体表达的影响和机制。方法在大鼠H9c2心肌细胞中加入不同浓度的衣霉素(TM)(1、5、10、20和50μmol/L)复制ERS模型,利用活细胞计数法试剂盒检测细胞存活率。Western blot检测凋亡相关蛋白(C-caspase3、GRP78、Bax、Bcl-2)和PERK-e IF2α-ATF4信号通路相关蛋白(p-PERK、p-e IF2α、ATF4),CHOP蛋白,FGF21及其主要受体(p-FGFR1和β-Klotho)的表达。结果与对照组比较,TM处理组诱导H9c2细胞发生ERS,提高促凋亡蛋白C-caspase3、GRP78、Bax的表达,减少抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,并以浓度依赖形式降低细胞的存活率。此外,当TM浓度≤10μmol/L时,TM处理组可以部分激活PERK-e IF2α-ATF4信号通路,诱导FGF21、p-FGFR1、β-Klotho的表达;当TM浓度>10μmol/L时,TM处理组完全激活PERK-e IF2α-ATF4信号通路,诱导CHOP的表达,而FGF21、p-FGFR1及β-Klotho表达却随TM浓度的增加而逐渐降低。结论 FGF21及其主要受体的表达与ERS程度有关,轻微的ERS(TM浓度≤10μmol/L)诱导心肌细胞FGF21及其受体的表达,而严重的ERS(TM浓度>10μmol/L)则相对降低FGF21及其受体的表达,其机制可能与PERK-e IF2α-ATF4信号通路在ERS中的调控有关。

线粒体DNA异质性检测方法研究进展

线粒体是真核细胞内的重要细胞器,能量生成的场所,参与脂肪酸的合成及某些蛋白质的合成,也是核外惟一的遗传物质。线粒体在生物的生长、发育、代谢、衰老、疾病、死亡以及生物进化等方面都有非常重要的意义。由于线粒体DNA具有母系遗传、拷贝数多、阈值效应、较高的突变率和序列的多样性等特点,因此线粒体DNA异质性在生物学、医学、法医、生物技术等领域有重要的应用。近几年来,mtDNA异质性研究的新成就为揭示许多疾病的发生机制提供了新的线索。现就线粒体DNA异质性检测方法及研究等进行综述。

人骨髓间充质干细胞玻璃化冷冻复苏后的生物学活性

目的探讨人骨髓间充质干细胞(BMSCs)玻璃化冷冻复苏后细胞的存活率和诱导分化能力。方法体外分离纯化人BMSCs,流式细胞仪检测其纯度。应用玻璃化冷冻方法进行冷冻保存,复苏后台盼蓝染色鉴定存活率。在DMEM/F12培养的BMSCs中加体积分数0.10的胎牛血清和10μg/L重组人碱性成纤维细胞生长因子预诱导2d,再加0.1μmol/L全反式维甲酸和10μg/L胶质细胞系源性神经营养因子进行正式诱导3d,免疫荧光染色检测Nestin、微管相关蛋白(MAP2)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、胶质纤维蛋白(GFAP)的表达。结果 BMSCs强表达CD44和CD90,不表达CD34和CD45。玻璃化冷冻解冻后细胞存活率>95%。经诱导后,BMSCs强阳性表达MBP和GFAP,弱阳性表达Nestin和MAP2。结论玻璃化冷冻复苏后的人BMSCs存活率高并能成功诱导为神经胶质细胞。

附睾上皮细胞体外培养模式综述

附睾上皮细胞培养和永生化方法的确立,对研究生殖系统疾病以及附睾特异表达基因的功能具有重要意义。本文对附睾上皮细胞体外培养模式做简要综述。

醛固酮合成酶基因-344T/C多态性与山东省汉族人原发性高血压相关性

目的 研究醛固酮合成酶基因 - 344 T/ C多态性是否与山东省汉族人原发性高血压相关。方法 放免法检测山东省 14 7例原发性高血压患者血浆肾素活性 (plasma renin activity,PRA)和醛固酮浓度 (plasma aldosterone concentration,PAC) ,以 PAC/ PRA比值将高血压患者分为低肾素、正常肾素或高肾素组 ;聚合酶链反应 -限制性片段长度多态性技术检测高血压 (14 7例 )和对照组 (110名 )醛固酮合成酶基因 - 344 T/ C多态性 ,χ2 检验比较各组基因型和等位基因频率。结果 对照组与原发性高血压组之间基因型和等位基因频率差异无显著性 ;对照组与正常或高肾素组之间基因型和等位基因频率差异亦无显著性。低肾素组 C等位基因频率显著高于对照组和正常或高肾素组 (P<0 .0 5 )。结论 醛固酮合成酶基因 -344 T/ C多态性与山东省汉族人低肾素型原发性高血压存在相关性。

Survivin在后发性白内障动物模型中的表达

目的建立新西兰大白兔后发性白内障(PCO)动物模型,检测凋亡抑制因子Survivin在PCO中的表达,探讨Survivin在PCO形成过程中的作用。方法选用健康新西兰大白兔30只,随机分为对照组(5只)、实验组(25只)。对照组直接处死;实验组行右眼晶状体超声乳化吸出术,分别于术后即刻,3、7、14、28 d(每个时间点5只)对术眼行裂隙灯显微镜检查,然后处死。获取对照组及实验组右眼撕除部分前囊膜的囊袋,采用Western blotting和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测Survivin在对照组及实验组不同时间点PCO中的表达。结果 Western blotting和RT-PCR在对照组及实验组术后即刻均未检测到Survivin的表达,实验组术后3、7、14、28 d PCO组织中可检测到不同程度Survivin的表达,其中术后7 d达到高峰,术后14 d表达开始下降。结论 Survivin的表达在PCO的形成过程中具有相应的时相性,提示Survivin与PCO的形成具有一定的相关性。