TH和GDNF双基因表达载体的构建及其在MES23．5细胞中的表达

目的构建酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)和胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)双基因表达载体并检测其在体外的表达,为帕金森病提供新的治疗措施。方法采用分子克隆技术,从pWAV2-TH质粒酶切获得人TH基因片段,将其克隆入真核表达质粒载体pIRES的上游,构建出pIRES-TH。PCR法扩增小鼠GDNF基因片段,克隆入pIRES-TH的下游,构建出携带TH和GDNF双基因的重组质粒pIRES-TH-GDNF。用酶切电泳验证重组结果的正确性,测序检测质粒重组后的序列。随后将重组质粒用Lipofectamine2000转染至MES23.5细胞,经G418筛选后,以RT-PCR及免疫荧光法检测TH和GDNF基因在mRNA及蛋白水平的表达。结果重组质粒酶切后其片段大小与预期结果相同,测序发现基因序列完全正确。转染后MES23.5细胞中TH和GDNF基因的水平明显升高(P<0.05)。结论重组pIRES-TH-GDNF质粒构建成功并能在体外正确表达TH和GDNF基因。