内质网跨膜蛋白EVA1A对肝细胞癌Huh7细胞生物学行为的影响

目的探讨内质网跨膜蛋白EVA1A在肝细胞癌(HCC)中的表达及对人肝细胞癌Huh7细胞生物学行为的影响。方法采用实时荧光定量PCR和免疫组化法检测EVA1A在HCC患者癌组织和癌旁正常组织中的表达;通过Western blot检测肝细胞L02与HCC细胞系Huh7中EVA1A的表达量;HCC细胞Huh7过表达EVA1A后,通过MTT法、细胞划痕法、DAPI染色观察EVA1A对Huh7细胞增殖、迁移和凋亡的影响。结果EVA1A在HCC患者癌组织和HCC细胞系Huh7中的表达较癌旁正常组织和正常肝细胞L02均显著降低(t=33.23、17.98,P<0.01)。与对照组相比,实验组过表达EVA1A后细胞增殖水平显著减弱(F=39.74、44.50,P<0.01);细胞迁移能力明显下降(t=7.09,P<0.05);实验组细胞发生典型的凋亡细胞形态学改变,相对凋亡率明显增加(t=-16.43,P<0.05)。结论EVA1A在HCC患者和HCC细胞系Huh7中的表达均下调。EVA1A过表达可抑制Huh7细胞增殖和迁移,诱发细胞凋亡。

核糖体调控因子1对人乳腺癌MDA-MB-468细胞增殖和转移能力的影响

目的探讨核糖体合成调控因子1(RRS1)对人乳腺癌细胞增殖和转移能力的影响。方法通过Western Blot实验检测人乳腺癌细胞系(MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT549、MCF-7细胞)以及正常人乳腺上皮细胞中RRS1蛋白的表达量;将MDA-MB-468细胞分别感染sh-RRS1慢病毒(sh-RRS1组)和阴性对照慢病毒(Con组),未进行任何感染的MDA-MB-468细胞为Blank组,在荧光显微镜下观察Con组和sh-RRS1组慢病毒感染效率,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术和Western Blot实验分别检测各组细胞中RRS 1 mRNA和蛋白的表达水平;采用CCK-8实验检测RRS1对MDA-MB-468细胞活力的影响;采用划痕实验、Transwell实验以及侵袭实验检测RRS1对MDA-MB-468细胞侵袭和迁移能力的影响。结果各乳腺癌细胞系中RRS1的表达水平均明显高于正常人乳腺上皮细胞(F=28.71,P<0.05);相较于Blank组和Con组,sh-RRS1组细胞中RRS 1 mRNA和蛋白的表达水平均显著降低(F=118.10、335.40,P<0.05),细胞增殖活力明显减弱(F=825.60~2839.00,P<0.05),侵袭和迁移能力明显降低(F=25.60~430.80,P<0.05)。结论RRS 1基因可能参与了乳腺癌细胞的增殖和转移过程,其作用可能与细胞中RRS 1的高表达有关。

有丝分裂激酶Aurora B对染色体形态变化的影响

目的探究有丝分裂激酶Aurora B对HeLa细胞染色体形态变化影响及其可能的作用机制。方法在HeLa细胞中加入二甲基乙酰胺(DMA),观察染色体形态的变化;将HeLa细胞分为A、B组,分别加入DMSO和Aurora B激酶抑制剂处理,应用Western blot检测两组组蛋白H3 S10的磷酸化水平,利用免疫荧光技术、活细胞成像和细胞染色体分离实验检测两组细胞的染色体形态变化;在B组细胞处理的基础上加入磷酸酶抑制剂处理(C组),利用免疫荧光技术检测磷酸酶对染色体形态变化的影响;使用小干扰RNA(siRNA)筛选Aurora B激酶的底物蛋白。结果A组和B组细胞中组蛋白H3 S10磷酸化水平比较差异有显著性(t=23.58,P<0.05)。B组加入Aurora B激酶抑制剂处理30、60、90 min时染色体聚集细胞数量较A组显著增多,差异具有统计学意义(F=379.28~738.73,P<0.05),抑制Aurora B激酶能够促进染色体的聚集。A组、B组、C组染色体聚集的细胞数量差异有显著性(F=969.20,P<0.05),其中C组明显低于B组(t=22.41,P<0.05)。siRNA筛选结果显示,染色体上可能存在多种Aurora B激酶的底物蛋白影响染色体的形态变化。结论有丝分裂激酶Aurora B通过磷酸化多种底物蛋白使染色体处于分散状态,而磷酸酶则发挥去磷酸化作用促进染色体的聚集,两者协同调控有丝分裂染色体的形态变化。

基于AS1411适配体的DNA-RNA杂交载体的抗肿瘤研究

目的研究连接适配体的DNA-RNA分子作为杂交载体靶向肿瘤细胞并导入功能性RNA分子进入细胞的有效性,以及对肿瘤细胞的影响。方法设计合成短的互补DNA、RNA分子,组装成DNA-RNA杂合链;连接AS1411适配体为靶向分子,再分别连接p21 saRNA和TIGIT siRNA作为药物分子,记为P21 saRNA和TIGIT siRNA,构成杂交载体,通用结构式为AS1411-DNA/RNA-sxRNA;检测AS1411-DNA/RNA-sxRNA能否靶向结合并进入肿瘤细胞及其对瘤细胞生存、迁移、侵袭和凋亡的影响。结果将设计的杂交载体各部分等摩尔加入杂交缓冲体系并于特定温度条件下孵育,TBM聚丙烯酰胺凝胶电泳检测到AS1411-DNA/RNA-sxRNA成功组装;AS1411-DNA/RNA-sxRNA杂交载体在10%血清条件下也显示出良好的抗降解稳定性;荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察,SKOV3细胞表面及胞内存在绿色大量荧光信号,杂交载体成功进入肿瘤细胞。杂交载体孵育后:在mRNA水平上,p21基因表达(2.14±0.25)是对照组(1.02±0.10)2倍以上,P<0.05;TIGIT基因表达(0.63±0.09)低于对照组(1.09±0.15),P<0.05;在蛋白质水平上,p21基因表达(1.57±0.16)是对照组(1.10±0.09)1.5倍以上,P<0.05;TIGIT基因表达(0.61±0.12)低于对照组(1.01±0.07),P<0.05。CCK-8实验显示,P21saRNA(3.10±0.13)和TIGIT siRNA(2.91±0.13)杂交载体孵育组与空白对照组(3.67±0.15)相比,卵巢癌细胞增殖能力显著下降(P<0.05);划痕实验结果显示,P21 saRNA孵育组愈合率(42.53±2.90)%、TIGIT siRNA孵育组愈合率(36.23±3.43)%,明显低于空白对照组(76.47±3.64)%,P<0.05;Transwell检测迁移能力发现:P21 saRNA孵育组(128.25±5.36)、TIGITsiRNA孵育组(119.50±8.79)低于对照组(186.5±8.56);侵袭能力:P21saRNA孵育组(145.5±9.45)、TIGITsiRNA孵育组(112.25±5.63)也显著低于对照组(202.50±10.12),P<0.05;细胞凋亡率:P21saRNA孵育组(11.74%±2.47%)、TIGIT siRNA孵育组(17.12%±2.04%)明显高于对照组(5.66%±1.44%),P<0.05。结论所制备的AS1411-DNA/RNA-sxRNA杂交载体能够有效靶向肿瘤细胞,携带功能性小RNA靶向导入肿瘤细胞并调控目的基因表达,使肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力受到抑制;该结果为利用DNA-RNA偶联AS1411适配体作为靶向工具的杂交载体,靶向杀伤表面表达NCL蛋白的肿瘤细胞提供了实验基础。

RRS1对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响及其作用机制

目的探讨核糖体合成调控因子1(RRS1)基因对乳腺癌BT549细胞增殖和迁移的影响及其作用机制。方法通过Western Blot实验检测人乳腺癌细胞系(MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT549、MCF-7细胞)和人正常乳腺上皮MCF-10A细胞RRS1蛋白的表达量。通过免疫荧光检测RRS1在BT549细胞中的定位。慢病毒感染法建立RRS1敲低的BT549细胞系,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western Blot实验检测感染阴性对照慢病毒细胞(Con组)和感染shRNA-RRS1慢病毒细胞(sh-RRS1组)中RRS1 mRNA和蛋白相对表达量。采用CCK8实验和集落形成实验检测RRS1对BT549细胞增殖能力的影响,通过细胞划痕实验、Transwell实验检测RRS1对BT549细胞迁移能力的影响。采用Western Blot实验检测两组细胞AKT-mTOR相关信号通路蛋白及其下游缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)蛋白相对表达量。结果MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT549、MCF-7乳腺癌细胞系中RRS1相对表达量与人正常乳腺上皮MCF-10A细胞相比均显著增高(F=48.92,P<0.05)。免疫荧光染色显示,RRS1主要在BT549细胞的细胞核和核仁表达,细胞质也有少量表达。与Con组进行比较,sh-RRS1组RRS1 mRNA和蛋白表达量显著降低,增殖和迁移能力均明显减弱,p-AKT、p-mTOR、HIF-1α、VEGF蛋白表达量均显著降低(t=6.29~32.04,F=1368.00、2699.00,P<0.05)。结论RRS1可能通过AKT-mTOR通路促进乳腺癌细胞的增殖和迁移。

lncRNA SNHG 1对乳腺癌细胞迁移、侵袭和上皮-间质转化的影响及其机制

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)核仁小分子RNA宿主基因1(SNHG 1)对乳腺癌细胞迁移、侵袭和上皮-间质转化(EMT)的影响及其作用机制。方法收集20例乳腺癌患者的癌组织与癌旁正常组织,培养人正常乳腺上皮细胞MCF-10A及乳腺癌细胞MCF-7、BT-549、MDA-MB-231和MDA-MB-468,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测组织和细胞中SNHG 1与miR-641表达量。以BT-549细胞为研究对象,分为A~D组,分别转染si-NC(A组)、si-SNHG1(B组)、si-SNHG1+anti-miR-641-NC(C组)、si-SNHG1+anti-miR-641(D组),采用RT-qPCR检测细胞中SNHG 1和miR-641表达量,采用Transwell实验检测细胞侵袭和迁移能力,用Western blot检测细胞EMT相关蛋白E-cadherin、N-cadherin和Vimentin表达量。将BT-549细胞分为E~H组,分别共转染SNHG1-WT与miR-641 mimics(E组)、SNHG1-WT与miR-NC(F组)、SNHG1-MUT与miR-641 mimics(G组)以及SNHG1-MUT与miR-NC(H组),采用双荧光素酶报告基因实验验证SNHG 1和miR-641间是否存在互作。结果SNHG 1在乳腺癌组织中高表达(t=4.81,P<0.05),miR-641在乳腺癌组织中低表达(t=7.96,P<0.05)。与正常乳腺上皮细胞MCF-10A相比,4种乳腺癌细胞中SNHG 1表达明显上调(t=8.11~10.79,P<0.05),而miR-641表达明显降低(t=9.16~11.17,P<0.05)。相较于A组,B组BT-549细胞的迁移及侵袭能力降低,N-cadherin和Vimentin蛋白表达量降低,E-cadherin蛋白和miR-641表达升高(t=3.95~19.45,P<0.05)。相较于C组,D组BT-549细胞迁移、侵袭能力增强,N-cadherin和Vimentin蛋白表达升高,E-cadherin蛋白表达降低(t=3.59~13.83,P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验结果显示,E组荧光素酶活性低于F组(t=8.37,P<0.05),G组与H组荧光素酶活性比较无统计学差异(P>0.05)。结论SNHG 1在乳腺癌组织和细胞中高表达,下调其表达可通过靶向miR-641抑制乳腺癌细胞迁移、侵袭及EMT过程。

ADSCs-CM对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞神经保护作用及其机制

目的 探讨人脂肪间充质干细胞条件培养基(ADSCs-CM)对1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)诱导的SH-SY5Y细胞神经保护作用及其机制。方法 将SH-SY5Y细胞分为Ctrl组、PD组、CM组,Ctrl组置于基础培养基中培养,PD组于MPP+(1.0 mmol/L)+基础培养基中培养,CM组于MPP+(1.0 mmol/L)+ADSCs-CM培养,均培养24 h。分别使用活性氧(ROS)试剂盒、三磷酸腺苷(ATP)试剂盒、线粒体复合物Ⅰ(CⅠ)活性试剂盒检测各组SH-SY5Y细胞中ROS含量、ATP总量和线粒体CⅠ活性;使用单丹磺酰尸胺(MDC)荧光法观察各组SH-SY5Y细胞自噬率;采用Western blot方法检测各组SH-SY5Y细胞线粒体自噬相关蛋白P62、LC3的表达水平。结果 PD组与Ctrl组、CM组比较,SH-SY5Y细胞的ROS含量、ATP总量、线粒体CⅠ的活性、细胞自噬率、P62、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相对表达量比较差异均有显著性(tLSD=3.23~12.61,P<0.05)。结论 ADSCs-CM可改善MPP+诱导的SH-SY5Y细胞中线粒体的功能障碍,其作用机制可能是通过影响自噬相关蛋白P62、LC3的表达实现的。

吲哚-2,3-二酮对SH-SY5Y细胞增殖与迁移的影响及其机制

目的研究吲哚-2,3-二酮(ISA)对SH-SY5Y细胞增殖与迁移的影响及其机制。方法采用CCK-8实验检测ISA对SH-SY5Y细胞活力的影响,并计算其半致死浓度(IC50值)作为后续实验中浓度设定的参考值。以IC50值为依据,向SH-SY5Y细胞中分别加入总浓度为0、50、100、200μmol/L的ISA(A、B、C、D组),采用平板克隆实验、划痕实验、细胞凋亡率检测及PI染色流式细胞仪(FCM)分析实验检测ISA对各组SH-SY5Y细胞增殖、迁移、凋亡及细胞周期的影响。采用Western blot实验检测各组SH-SY5Y细胞中Bax、Bcl2等蛋白的相对表达量。结果CCK-8实验结果显示,随着ISA浓度的增加,SH-SY5Y细胞活力明显下降(F=1632.62,P<0.05);平板克隆结果显示,随着ISA药物浓度的增加,细胞的集落形成能力被抑制(F=1038.21,P<0.05);划痕实验结果显示,细胞的迁移能力随着ISA浓度的增加而明显下降(F=147.86,P<0.05);流式细胞仪检测结果显示,随着ISA浓度增加,细胞的凋亡率明显增高(F=557.71,P<0.05);PI染色法结果显示,随着ISA浓度的增加,细胞的G1周期构成比明显增高(F=632.38,P<0.05);Western blot实验结果显示,随着ISA浓度的增加p-JAK2、p-STAT3及Bcl2蛋白的表达量明显下降(F=286.56~541.13,P<0.05),而Bax的蛋白表达水平则明显升高(F=464.50,P<0.05)。结论ISA可以有效地抑制神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的增殖以及迁移,其抑制作用可能是通过调节JAK2/STAT3通路实现的。

新型Hsp90/HDAC双靶点抑制剂对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、侵袭和迁移的影响及其机制

目的 研究新型热休克蛋白90(Hsp90)/组蛋白去乙酰化酶(HDAC)双靶点抑制剂FXX-W-12-4对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响及其机制。方法 采用CCK-8实验检测FXX-W-12-4对MDA-MB-231细胞活力的影响,并计算其半致死浓度(IC50)作为后续实验中浓度设定的参考值。以IC50值为依据,在MDA-MB-231细胞中分别加入终浓度为0、100、200、300 nmol/L的FXX-W-12-4(分别设为A、B、C、D组),采用划痕实验、Transwell实验分别检测FXX-W-12-4对各组MDA-MB-231细胞侵袭以及迁移能力的影响。采用Western Blot实验检测各组MDA-MB-231细胞中ac-H3、Hsp70等蛋白的相对表达量。结果 CCK-8实验结果显示,随着FXX-W-12-4浓度的升高,MDA-MB-231细胞活力逐渐下降(F=2 663.00,P<0.05)。划痕实验结果显示,与A组相比,B~D组MDA-MB-231细胞在第12、24、48小时时迁移能力均明显降低(F=86.47~212.59,P<0.05)。Transwell实验结果显示,与A组相比,随着FXX-W-12-4浓度的升高,B~D组MDA-MB-231细胞的侵袭能力均受到了抑制(F=68.67,P<0.05)。Western Blot检测结果显示,与A组比较,随着FXX-W-12-4浓度的增加,B~D组MDA-MB-231细胞中ac-H3、Hsp70蛋白相对表达量显著性增高(F=645.60、1 017.00,P<0.05),而p-Akt、p-mTOR蛋白表达量显著性下降(F=480.30、14.32,P<0.05)。结论 新型Hsp90/HDAC双靶点抑制剂FXX-W-12-4可有效抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、侵袭和迁移,其抑制作用可能是通过调节Akt/mTOR通路实现的。

磷酸弗林酸性簇分选蛋白2对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥大的影响及其机制

目的探究磷酸弗林酸性簇分选蛋白2(PACS-2)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心肌肥大的影响及其机制。方法剪取并消化出生1~2 d的SD大鼠乳鼠的心脏组织,采用差速贴壁法获取乳鼠心肌细胞(NRCMs),原代培养24 h。以浓度为1.5μmol/L的AngⅡ处理NRCMs 0、3、6、12、24 h,采用Western blot方法检测细胞中FUN14域蛋白1(FUNDC1)、PACS-2、三磷酸肌醇受体蛋白(IP3R)的表达水平,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测细胞中心钠肽(ANP)、脑钠肽(BNP)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)mRNA的表达水平。将NRCMs分为A~C组,A组使用无血清培养基培养,B、C组分别转染si-NC和si-PACS-2,采用Western blot方法检测各组细胞中PACS-2蛋白的表达水平。将NRCMs分为D~G组,D组使用无血清培养基培养,E组以浓度0.15μmol/L的AngⅡ培养,F、G组分别转染si-NC、si-PACS-2后再以浓度0.15μmol/L的AngⅡ培养,采用TRITC-鬼笔环肽染色技术检测各组心肌细胞表面积,RT-qPCR检测各组细胞ANP、BNP、β-MHC mRNA的表达水平,以Fluo-4,AM探针检测各组细胞胞质Ca^(2+)的水平。将NRCMs分为H~K组,H组使用无血清培养基培养,I、J组分别转染si-NC、si-PACS-2,K组转染si-PACS-2并且以浓度1μmol/L的钙调蛋白(CaM)拮抗剂处理后,采用RT-qPCR方法检测各组细胞ANP、BNP、β-MHC mRNA的表达水平。结果以浓度1.5μmol/L的AngⅡ处理NRCMs 0、3、6、12、24 h,NRCMs中ANP、BNP、β-MHC mRNA的表达水平呈时间依赖性上调(F=25.73~58.30,P<0.05),并且处理第24小时时相较于第0小时时均显著上调(t=5.35~37.50,P<0.05)。以浓度1.5μmol/L的AngⅡ处理NRCMs 0、3、6、12、24 h,NRCMs中IP3R、PACS-2以及FUNDC1蛋白的表达水平均呈时间依赖性下调(F=5.37~9.07,P<0.05),并且处理第24小时时相较于第0小时时显著下调(t=6.55~7.42,P<0.05)。与B组相比,C组NRCMs中PACS-2蛋白的表达水平显著下调(t=5.92,P<0.05)。与F组相比,G组NRCMs中心肌细胞表面积增大,ANP、BNP、β-MHC mRNA的表达水平及胞质Ca^(2+)水平均上调(t=3.50~26.60,P<0.05)。与J组相比,K组NRCMs中ANP、BNP、β-MHC mRNA表达水平均显著下调(t=3.27~5.13,P<0.05)。结论敲低PACS-2可增加NRCMs中胞质Ca^(^(2+))水平,并且可能以Ca^(^(2+))-CaM依赖的方式加重AngⅡ诱导的心肌肥大的发生。

从干扰素诱导蛋白MxA筛选抗乙肝病毒活性肽

黏病毒抗性蛋白A(myxovirus resistance protein A,MxA)是由干扰素诱导的具有重要抗乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)功能的蛋白质,我们前期工作发现,MxA主要依赖其中心互作结构域(central interactive domain,CID)与病毒直接相互作用发挥功能,但其具体的抗病毒功能区以及功能区是否具有独立的抗病毒活性仍不清楚。本研究拟鉴定MxA蛋白上的抗乙肝病毒活性肽。首先从全长MxA构建缺失突变体ΔCID和截短体CID,以HepG2.2.15细胞为病毒模型,分别转染空载质粒、MxA、ΔCID和CID,免疫荧光法检测转染效率,Western印迹法检测质粒表达,酶联免疫法测定细胞培养液中HBsAg、HBeAg的量及荧光定量PCR法测定乙肝病毒DNA的量,评估CID段的抗乙肝病毒活性。根据CID段的晶体结构,缩短肽段长度,构建α1、α2、α3等9段肽段质粒,鉴定各段的抗乙肝病毒活性和细胞毒性(MTT法)。运用计算生物学手段——分子对接法预测MxA蛋白与病毒相互作用的模式和位点。结果显示,ΔCID、CID和9段肽段质粒的序列及表达正确,9段肽段的表达量未见显著性差异,无显著的细胞毒性。CID组和黏病毒抗性蛋白A组较对照组乙肝病毒的复制水平显著降低,CID组细胞上清中HBsAg、HBeAg及乙肝病毒DNA的量分别减少了55.57%±8.48%、68.37%±6.24%、66.67%±6.40%,P<0.01;MxA组的3个指标分别减少了61.63%±3.11%、70.77%±7.25%、73.73%±6.18%,P<0.01;ΔCID组较对照组无明显变化。9段肽段中α1组较对照组HBsAg、HBeAg及乙肝病毒DNA的量有显著下降,分别减少了48.33%±1.70%、70.67%±3.30%、68.95%±2.55%,P<0.001,表明α1对乙肝病毒具有强抑制活性。分子对接的结果显示,384~408位氨基酸是MxA蛋白与病毒互作的关键位点,该区域落在α1肽段上,验证了α1是MxA蛋白抗乙肝病毒及与乙肝病毒相互作用中的关键区段。本研究筛选并鉴定出人干扰素诱导蛋白MxA上最有效的抗乙肝病毒活性肽α1,研究结果为抗乙肝病毒多肽类新药的研发奠定了基础。

miR-103a-3p对肝细胞癌细胞迁移能力的影响及其作用机制

目的探讨miR-103a-3p对肝细胞癌(HCC)细胞迁移能力的影响及其作用机制。方法采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测miR-103a-3p在正常肝细胞L02和HCC细胞系Hccl-M3中的表达;将Hccl-M3细胞按照实验要求分为A、B、C、D、E组,各组分别转染mimics NC、miR-103a-3p mimics、inhibitor NC、miR-103a-3p inhibitor以及miR-103a-3p mimics与TMEM166-Myc,采用Western blot方法检测miR-103a-3p对内质网跨膜蛋白TMEM166表达的影响;通过细胞划痕法检测miR-103a-3p表达对Hccl-M3细胞迁移能力的影响;通过micro-RNA靶基因数据库starBase预测miR-103a-3p与TMEM166可能的结合位点;将293T细胞分为F、G、H以及I组,各组分别转染mimics NC与TMEM166-3UTR-wt、miR-103a-3p mimics与TMEM166-3UTR-wt、mimics NC与TMEM166-3UTR-mu、miR-103a-3p mimics与TMEM166-3UTR-mu,检测每组细胞中荧光素酶活性,分析miR-103a-3p对TMEM166的靶向调控作用。结果RT-qPCR法检测结果显示,HCC细胞系Hccl-M3中miR-103a-3p的表达高于正常肝细胞L02(t=13.49,P<0.05)。Western blot检测结果显示,组间细胞TMEM166蛋白表达水平比较差异有显著性(F=276.20,P<0.05);B组细胞TMEM166蛋白表达水平低于A组(t=22.33,P<0.05),D组细胞TMEM166蛋白表达水平高于C组(t=9.72,P<0.05)。双荧光素酶报告基因结果显示,组间细胞荧光素酶活性比较差异有显著性(F=122.90,P<0.05),G组细胞荧光素酶活性显著低于F组(t=23.17,P<0.05)。划痕实验结果显示,组间细胞迁移率比较差异有显著性(F=16.83,P<0.05);B组细胞迁移率明显高于A组(t=4.13,P<0.05),D组细胞迁移率明显低于C组(t=4.33,P<0.05),E组细胞迁移率明显低于B组(t=4.91,P<0.05)。结论miR-103a-3p通过抑制TMEM166的表达促进HCC细胞系Hccl-M3的迁移。

靶向肝癌细胞HepG2和SMMC-7721核酸适配体的筛选及鉴定

目的 以人肝癌细胞HepG2和SMMC-7721作为混合靶标筛选获得特异性核酸适配体并对其进行鉴定。方法 以HepG2和SMMC-7721两种人源肝癌细胞为筛选混合靶标,利用细胞指数富集的配基系统进化(Cell-SELEX)技术筛选获得核酸适配体。利用流式细胞术检测文库富集情况,将富集文库进行克隆、测序,应用RNA structure、MEME在线软件进行序列分析,再次通过流式细胞术鉴定核酸适配体与靶标的结合能力及特异性。结果 通过10轮Cell-SELEX筛选得到核酸适配体10-8,流式细胞术检测显示核酸适配体10-8与人源肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721细胞结合,且特异性靶向肝癌细胞。结论 筛选获得与人源肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721双靶标特异性结合的核酸适配体10-8。

乳腺癌细胞来源的外泌体对乳腺癌BT549细胞增殖、侵袭和迁移的影响

目的研究乳腺癌细胞来源的外泌体对乳腺癌BT549细胞的增殖、侵袭和迁移的影响。方法使用超速离心的方法对人乳腺癌BT549细胞培养液中的外泌体进行提取和纯化,以通用透射电子显微镜观察外泌体的形态和大小,蛋白免疫印迹实验鉴定外泌体的标志蛋白,以CCK-8实验、细胞划痕实验和Transwell实验检测外泌体对BT549细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。结果透射电子显微镜下外泌体的形状为椭圆形,外包被一层磷脂膜,直径40~110 nm;蛋白免疫印迹实验结果显示外泌体内标志蛋白TSG101以及外标志蛋白CD63均明显富集;CCK-8实验结果显示共培养24 h后,实验组的BT549细胞增殖力较对照组明显增强(F=12.99~50.95,P<0.001);细胞划痕实验结果显示外泌体明显促进了BT549细胞的迁移(t=8.93,P<0.01);Transwell实验结果显示实验组BT549细胞迁移数较对照组明显增多(t=4.77,P<0.01)。结论乳腺癌细胞来源的外泌体能促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移,表明肿瘤来源外泌体可作为交叉信号的传递平台,在促进肿瘤的生长和肿瘤转移方面发挥自分泌作用。

体外合成的ABC转运蛋白2 mRNA在小鼠体内表达促进尿酸排泄

高尿酸血症是指嘌呤代谢紊乱尿酸在体内堆积所导致的慢性代谢疾病,近年来其发病率增高且发病年龄呈现年轻化趋势,寻找有效的治疗靶点以及治疗方法是当前研究的热点。尿酸盐转运蛋白ABC转运蛋白2(ATP-binding cassette subfamily G member 2,ABCG2)主要表达于肾,促进尿酸排泄。本研究通过体外合成ABCG2 mRNA,将其转染至高尿酸血症模型小鼠体内,观察对小鼠尿酸的影响及其相关作用。化学合成ABCG2 mRNA的DNA模板,体外转录mRNA修饰后转染到小鼠肾小管上皮细胞TCMK-1,Western印迹检测细胞中的蛋白质表达。结果显示,TCMK-1细胞中的蛋白质表达量与mRNA转染量呈正相关(P<0.01),提示转染成功。动物实验,将24只SPF级小鼠随机分为正常组、高尿酸血症模型组、苯溴马隆治疗组[20 mg/(kg·d)]和mRNA治疗组[2 mg/(kg·3d)],共4组(n=6)。边造模边治疗持续28 d,治疗结束后检测其血尿酸、尿液中尿酸、血肌酐、血尿素氮和肝中黄嘌呤氧化酶指标。结果显示,与模型组小鼠相比,mRNA治疗能显著降低小鼠血尿酸(100.38±10.94)及血尿素氮(6.30±1.10)、肌酐(30.86±5.78)水平(P<0.05或P<0.01),升高小鼠尿液尿酸(617.48±50.34)水平(P<0.05),促进尿酸排泄,对肝中黄嘌呤氧化酶活性(26.19±2.58)无显著影响。HE染色观察小鼠肾病理结构改变。结果显示,与模型组小鼠相比,mRNA治疗组小鼠肾内肾小管细胞水肿、炎细胞浸润等病理损伤得到明显改善。qRT-PCR检测小鼠肾组织mRNA相对表达量,免疫组化、Western印迹检测小鼠肾ABCG2蛋白质表达水平。结果显示,mRNA组小鼠肾组织中ABCG2 mRNA及其蛋白质相对表达量明显上调(P<0.01)。综上所述,体外修饰合成的ABCG2 mRNA可以在高尿酸小鼠模型体内成功表达,并促进尿酸及其它有机离子排泄,同时改善小鼠肾损伤。该结果为临床利用ABCG2基因作为治疗高尿酸血症相关疾病的靶点提供了实验依据。

肿瘤特异性蛋白B7-H4纳米抗体的筛选和鉴定

羊驼体内存在天然缺少轻链的重链抗体,克隆重链抗体可变区(VHH),即可构建单域抗体(single-domain antibodies,sdAbs),又称纳米抗体(nanobody,Nb)。利用非免疫羊驼噬菌体文库筛选肿瘤特异性蛋白B7-H4的纳米抗体,经过4轮淘选,ELASE鉴定阳性克隆噬菌体,测序获得其DNA序列后体外转录为mRNA,将修饰纯化后的mRNA转染到肿瘤细胞,利用细胞免疫荧光检测mRNA在肿瘤细胞内是否表达,Western印迹进一步验证其表达情况;通过CCK-8法鉴定其对肿瘤细胞的增殖抑制能力;划痕实验鉴定其对肿瘤细胞迁移能力的影响;Transwell法鉴定其对肿瘤细胞的侵袭能力的影响;裸鼠荷瘤模型瘤旁注射mRNA,鉴定其在体内实验对肿瘤组织的作用。结果显示,通过淘选获得1个高亲和性的噬菌体株菌H6;DNA测序并导出的氨基酸序列符合羊驼纳米抗体结构;将其mRNA导入肿瘤细胞,能有效表达出纳米抗体H6;转染H6-mRNA的肿瘤细胞(0.84±0.08)与未转染H6-mRNA的对照组(1.83±0.04)相比,其增殖能力明显受到抑制,P<0.01,其迁移和侵袭能力(78.60±5.36)明显低于空白对照组(197.80±21.04),效果优于B7-H4 mRNA的siRNA(95.40±16.56);在裸鼠乳腺癌模型中能有效抑制肿瘤生长,效果优于紫杉醇和B7-H4 mRNA的siRNA。这说明筛选所得抗B7-H4纳米抗体H6能特异结合B7-H4蛋白并封闭其功能,导致肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭受到抑制。该结果为利用B7-H4作为治疗癌症的靶点提供了实验基础。

TP53INP2/DOR在转录调控、细胞自噬和相关疾病中的作用

肿瘤蛋白p53诱导的核蛋白2(TP53INP2),也称糖尿病与肥胖调控蛋白(DOR),在骨骼肌、心肌和脑等代谢旺盛的组织中表达水平较高。TP53INP2在细胞核内主要发挥转录辅激活因子的作用,如作为甲状腺激素受体的辅激活因子调控甲状腺激素相关基因的表达。后续研究发现,TP53INP2为细胞内重要的分解代谢途径—细胞自噬所必需,饥饿时TP53INP2出核参与自噬的起始。在骨骼肌中,TP53INP2通过促进自噬导致肌肉流失,而在白色脂肪组织中,TP53INP2则通过促进自噬抑制脂肪前体细胞的分化。此外,在营养丰富的条件下,TP53INP2能够定位于核仁,协助r DNA转录起始前复合物的组装,促进r DNA的转录,参与细胞内重要的合成代谢—核糖体的生物发生。临床统计数据表明,TP53INP2的表达水平与糖尿病和某些类型的癌症早期的发生发展密切相关。本文对TP53INP2在转录调控、细胞自噬和相关疾病如癌症与糖尿病中的生物学功能进行综述。

核糖体合成调控因子1对乳腺癌细胞阿霉素抗性的影响

目的探讨核糖体合成调控因子1(RRS1)对乳腺癌细胞阿霉素抗性的影响。方法通过Western blot方法检测MCF-7和耐阿霉素MCF-7/ADR细胞中RRS1的表达;构建携带绿色荧光蛋白的shRRS1慢病毒和阴性对照慢病毒,分别感染MCF-7/ADR细胞(实验组与对照组),荧光显微镜下观察慢病毒转染效率,采用Wes-tern blot检测实验组和对照组细胞中RRS1的表达量,确定沉默效率;采用CCK8法检测实验组和对照组细胞对阿霉素的敏感性差异;采用流式细胞术分析实验组和对照组细胞内阿霉素累积量的差异;采用平板克隆实验、流式细胞术检测实验组和对照组细胞增殖和凋亡情况。结果MCF-7/ADR细胞中RRS1的表达量明显高于MCF-7细胞(t=13.05,P<0.05);与对照组相比,实验组细胞中RRS1蛋白表达水平明显降低,阿霉素对MCF-7/ADR细胞的IC50值明显降低,细胞内阿霉素的累积量明显升高,细胞增殖能力明显降低,凋亡率明显升高(t=2.87~122.40,P<0.05)。结论RRS1在耐阿霉素乳腺癌MCF-7/ADR细胞中高表达,沉默RRS1表达可显著抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡,降低MCF-7/ADR细胞对阿霉素的抗性。

RRS1对乳腺癌细胞MDA-MB-231侵袭转移的影响及其作用机制

目的探讨核糖体合成调节因子1(RRS1)基因对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭转移的影响及其作用机制。方法体外培养乳腺癌MDA-MB-231细胞、BT549细胞、人正常乳腺上皮HMEC细胞,采用Western blot方法检测以上细胞中RRS1蛋白的相对表达情况。乳腺癌MDA-MB-231细胞分别转染慢病毒shRNA-Ctrl、shRNA-RRS1、空载质粒及RRS1过表达质粒后,细胞分为空白处理组(A组),转染shRNA-Ctrl组(B组),转染shRNA-RRS1组(C组),转染Vector组(D组),转染Vector-RRS1组(E组),转染48 h后,采用Western blot方法检测5组细胞中RRS1蛋白相对表达情况,采用划痕实验、Transwell实验检测RRS1基因对乳腺癌细胞迁移和侵袭能力影响;采用Western blot方法检测MDA-MB-231细胞E钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、磷酸化蛋白激酶B(P-AKT)、糖原合成激酶3(GSK3β)、锌指转录因子(Snail)蛋白的相对表达情况。结果Western blot方法检测结果显示,乳腺癌MDA-MB-231、BT549细胞中的RRS1蛋白相对表达量明显高于正常乳腺上皮HMEC细胞(F=74.71,P<0.01)。Western blot方法检测结果显示,C组细胞中RRS1蛋白相对表达量明显低于A、B组,E组细胞中RRS1蛋白的相对表达量明显高于A、B、C、D组(F=33.26,P<0.01)。Transwell小室和划痕实验结果显示,与A、B组相比,C组细胞的侵袭和迁移能力降低,与A、D组相比,E组细胞侵袭和迁移能力升高(F=208.30、187.70,P<0.01)。Western blot检测结果显示,与A、B组相比,C组细胞中Vimentin、P-AKT、GSK3β、Snail蛋白相对表达量低,与A、D组相比,E组细胞中Vimentin、P-AKT、GSK3β、Snail蛋白相对表达量高(F=34.29~69.03,P<0.01),与A、B组相比,C组细胞中E-cadherin蛋白相对表达量高,与A、D组相比,E组细胞中E-cadherin蛋白相对表达量低(F=36.00,P<0.01)。结论RRS1可能参与了乳腺癌的侵袭和转移过程,且其作用可能与促进细胞上皮-间质转化有关。

RRS1在MPP^+诱导SH-SY5Y细胞凋亡过程中表达的变化及意义

目的探究核糖体合成调节因子1(RRS1)在1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP^+)诱导的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y凋亡过程中表达的变化及意义。方法以含有0、100、200、400μmol/L MPP^+的培养基培养SH-SY5Y细胞48 h,用CCK-8法检测各组细胞的增殖活力,用JC-1法检测细胞线粒体膜电位,采用Annexin V-APC/PI试剂盒检测细胞凋亡率,用Western blot检测细胞抑癌因子P53、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤-2蛋白(Bcl-2)与RRS1蛋白的表达。构建RRS1慢病毒过表达载体(Lv-RRS1)和慢病毒阴性对照载体,对细胞进行慢病毒转染后,用实时荧光定量PCR(qPCR)和Western blot检测慢病毒转染效率;对转染细胞以400μmol/L MPP^+处理48 h,用CCK-8检测细胞增殖活力,用Annexin V-APC/PI试剂盒检测细胞凋亡率,用Western blot检测细胞RRS1、P53、Bcl-2和Bax蛋白的相对表达情况。结果细胞经MPP^+处理培养,SH-SY5Y细胞增殖活力、线粒体膜电位显著降低(F=95.63、69.90,P<0.05);细胞凋亡率明显升高(F=258.49,P<0.01);P53蛋白和Bax蛋白表达明显升高(F=40.47、20.78,P<0.05);RRS1蛋白和Bcl-2蛋白表达明显降低(F=28.44、42.43,P<0.05)。慢病毒转染后,与对照组相比较,Lv-RRS1组RRS1 mRNA和蛋白表达量均明显增加(t=15.59、6.05,P<0.01);对转染的细胞以400μmol/L MPP^+处理48 h后,与对照组相比较,Lv-RRS1组细胞增殖活力显著升高(t=4.76,P<0.01);细胞凋亡率明显降低(t=5.80,P<0.01);RRS1蛋白和Bcl-2蛋白表达明显升高(t=12.41、3.14,P<0.05);P53蛋白和Bax蛋白表达显著降低(t=5.20、4.77,P<0.05)。结论RRS1在MPP^+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡中低表达,RRS1可能通过影响凋亡相关因子P53、Bax和Bcl-2蛋白的表达参与MPP^+诱导的SH-SY5Y细胞的凋亡。