右美托咪定对神经元氧糖剥夺/复氧损伤的保护作用

目的探讨右美托咪定(Dex)对皮质神经元氧糖剥夺/复氧(OGD/R)损伤的神经保护作用及其可能机制。方法培养孕18 d的SD大鼠胎鼠皮质神经元细胞,随机分为对照组(Sham组,加入有糖细胞外液置于正常培养箱中培养)、模型组(OGD/R组,加入无糖细胞外液,置于37℃厌氧箱中培养制备OGD/R细胞模型)、阳性药物对照组(OGD/R+LW6组,OGD/R模型细胞加入1 mmol/L的LW6处理1 h)、OGD/R+低浓度Dex组(OGD/R模型细胞加入0.1μmol/L Dex处理1 h)、OGD/R+高浓度Dex组(OGD/R模型细胞加入1.0μmol/L Dex处理1 h)。应用CCK-8比色法、免疫荧光方法检测各组细胞的存活率,Western blot方法检测各组低氧诱导因子1α(HIF-1α)、激活转录因子-6(ATF-6)及下游靶点C/EBP同源蛋白(CHOP)的表达水平。结果CCK-8比色及免疫荧光染色结果显示,各组神经元存活率差异有显著性(F=63.46,P<0.05);两两比较显示,OGD/R组神经元存活率较Sham组显著降低(P<0.05),OGD/R+高浓度Dex组神经元存活率较OGD/R组显著提高(P<0.05)。Western blot结果显示,各组神经元HIF-1α、ATF-6、CHOP蛋白表达差异有显著性(F=80.30~155.36,P<0.05);两两比较显示,OGD/R组HIF-1α、ATF-6、CHOP蛋白表达较Sham组升高(P<0.05),OGD/R+高浓度Dex组HIF-1α、ATF-6、CHOP蛋白表达较OGD/R组降低(P<0.05)。结论Dex通过抑制HIF-1α表达对OGD/R损伤的神经元模型发挥保护作用。

2-Iodomelatonin上调NRF2表达对缺血性脑损伤神经保护作用

目的探讨褪黑激素受体1(MT1)激动剂2-Iodomelatonin通过上调核因子E2相关因子2(NRF2)对大脑中动脉栓塞小鼠的神经保护作用。方法采用大脑中动脉栓塞(MCAO)法制备小鼠缺血性脑损伤体内模型,给予2-Iodomelatonin及NRF2抑制剂(Nrf2-IN-1)干预。采用三苯基氯化四氮唑(TTC)染色法检测小鼠大脑的梗死体积,Western Blot法检测缺血损伤后大脑皮质半暗带NRF2表达水平,改良神经功能缺损程度评分(mNSS)评估2-Iodomelatonin和Nrf2-IN-1干预对小鼠缺血性脑损伤亚急性期运动功能的影响。结果TTC染色结果显示,2-Iodomelatonin干预可以显著降低缺血性脑损伤小鼠的大脑梗死体积(F=7.79,q=5.06,P<0.05)。Western Blot结果显示,2-Iodomelatonin干预可上调小鼠皮质梗死半暗带NRF2的表达水平(F=10.56,q=3.99,P<0.05)。mNSS评分结果显示,2-Iodomelatonin干预可以显著改善缺血性脑损伤第14天的运动功能损伤(F=6.12,q=4.79,P<0.05),该效应可被Nrf2-IN-1逆转(q=3.60,P<0.05)。结论2-Iodomelatonin干预可以通过上调NRF2降低缺血性脑损伤小鼠的大脑梗死体积并改善14 d时的运动功能损伤。

芝麻素对氧糖剥夺损伤大鼠皮质神经元的作用及机制

目的探讨芝麻素(SSM)是否通过磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/核因子-红细胞样2相关因子2(Nrf2)信号通路对氧糖剥夺(OGD)损伤的大鼠皮质神经元发挥神经保护作用。方法原代培养SD大鼠大脑皮质神经元8 d后,构建体外脑缺血模型。采用CCK-8法检测不同浓度SSM对神经元存活率的影响,采用免疫印迹法检测最适作用浓度SSM处理后磷酸化丝氨酸/苏氨酸激酶(p-Akt)、Akt、Nrf2、血红素氧化酶-1(HO-1)蛋白表达水平。结果与Control组相比,OGD组神经元存活率下降,不同浓度的SSM处理均可增加OGD损伤后神经元的存活率(F=35.93,P<0.01),以25μmol/L的SSM作用最明显。各组氧化应激相关蛋白p-Akt、Nrf2、HO-1表达差异有统计学意义(F=23.47~32.21,P<0.01)。与OGD组相比,OGD+SSM组p-Akt、Nrf2、HO-1蛋白表达量均显著上调(P<0.05);与OGD+SSM组相比,OGD+SSM+LY294002组p-Akt、Nrf2、HO-1蛋白上调均被抑制(P<0.05)。各组Akt比较差异无显著性(P>0.05)。结论SSM通过激活PI3K/Akt/Nrf2信号通路,提高OGD损伤后神经元的存活率,发挥神经保护作用。

乙酸钠对氧糖剥夺皮质神经元损伤的作用及HIF-1α表达的影响

目的探讨乙酸钠(NaAc)对氧糖剥夺(OGD)损伤后皮质神经元的作用及低氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达的影响。方法将OGD处理的皮质神经元作为脑缺血模型,采用细胞存活实验(CCK-8)、乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测NaAc处理后的神经元存活情况,Western blot方法检测OGD损伤后、NaAc处理后神经元中HIF-1α蛋白表达;应用二甲基草酰甘氨酸(DMOG)、HIF-1α抑制剂(LW6)分别激动和抑制HIF-1α,观察NaAc是否通过抑制HIF-1α发挥神经保护作用。采用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色观察NaAc处理后大鼠脑组织梗死体积。结果TTC结果显示,NaAc处理可以减轻脑梗死体积(F=107.20,P<0.05)。体内细胞存活实验和LDH释放实验显示,NaAc可以减轻OGD对神经元的损伤(F=98.80、72.62,P<0.05),NaAc通过抑制HIF-1α表达促进神经元存活(F=43.57、97.52,P<0.05)。Western blot结果显示,NaAc可抑制正常神经元中HIF-1α蛋白的表达(t=7.84,P<0.05),OGD损伤后神经元HIF-1α蛋白表达增加(t=9.96,P<0.05),NaAc可抑制OGD损伤后神经元HIF-1α蛋白表达(F=74.74,P<0.05)。结论OGD损伤后,补充NaAc可通过抑制HIF-1α蛋白表达发挥神经保护作用。

AA147对Aβ诱导的阿尔茨海默病细胞模型的作用

目的探讨AA147能否通过激活内质网应激相关蛋白激活转录因子-6(ATF-6)对阿尔茨海默病细胞模型发挥保护作用。方法培养孕期为17~19 d的SD大鼠胎鼠皮质神经元,用β-淀粉样蛋白(Aβ)1-42诱导建立阿尔茨海默病细胞模型。实验随机分为对照组(10μmol/L的二甲基亚砜(DMSO)预处理神经元12 h)、Aβ1-42处理组(2μmol/L的Aβ1-42诱导神经元24 h)、Aβ1-42+DMSO组(10μmol/L的DMSO预处理神经元12 h后加入2μmol/L的Aβ1-42诱导神经元24 h)、Aβ1-42+AA147组(10μmol/L的AA147预处理神经元12 h后加入2μmol/L的Aβ1-42诱导神经元24 h)。采用CCK-8比色法、免疫荧光染色法检测各组神经元的存活率,Western blot法检测各组神经元中ATF-6及其下游蛋白p-Akt的表达情况。结果CCK-8检测显示,各组神经元存活率差异有显著意义(F=47.42,P<0.01),其中Aβ1-42组细胞活力较对照组明显降低(t=9.42,P<0.05),Aβ1-42+AA147组细胞活力较Aβ1-42组明显升高(t=5.73,P<0.05)。免疫荧光染色结果显示,Aβ1-42组神经元存活数量较对照组显著降低,Aβ1-42+AA147组较Aβ1-42组显著提高,Aβ1-42+DMSO组与Aβ1-42组比较无明显差异。Western blot结果显示,各组ATF-6及p-Akt蛋白表达差异有显著性(F=11.77、26.10,P<0.05),其中Aβ1-42组ATF-6及p-Akt蛋白表达明显低于对照组,Aβ1-42+AA147组高于Aβ1-42组,差异有统计学意义(P<0.05),而Aβ1-42+DMSO组与Aβ1-42组比较差异无显著性(P>0.05)。结论AA147可通过激活ATF-6及其下游信号通路p-Akt的表达发挥对阿尔茨海默病细胞模型的神经保护作用。

丙氨酸抑制PKM2表达对缺血性脑损伤保护作用

目的研究丙氨酸(Ala)在缺血性脑损伤中的神经保护作用以及Ala对M2型丙酮酸激酶(PKM2)表达水平的调节。方法体外培养原代神经元并构建氧-糖剥夺/再灌注(OGD/R)模型,将神经元随机分为对照组、OGD/R模型组以及OGD/R后Ala干预组(OGD/R+Ala),应用CCK-8方法检测Ala干预对神经元存活率的影响,Western blot方法检测Ala对OGD/R模型神经元内PKM2蛋白表达水平的影响。构建大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,随机将36只SD大鼠分为假手术组、MCAO组以及MCAO后Ala干预组(MCAO+Ala),每组12只,采用免疫荧光方法检测脑缺血/再灌注损伤后神经元内Ala含量的变化,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色观察各组脑梗死面积,Western blot方法检测Ala干预对缺血损伤脑组织中PKM2蛋白表达水平的影响。结果CCK-8与Western blot检测结果显示,各组神经元存活率及PKM2蛋白表达差异有显著性(F=86.88、20.83,P<0.05),OGD/R组细胞存活率较对照组显著降低,PKM2蛋白表达较对照组升高(t_(LSD)=4.65、10.95,P<0.05);OGD/R+Ala组细胞存活率较OGD/R组显著增加,PKM2蛋白表达较OGD/R组明显下降(t_(LSD)=4.98、4.69,P<0.05)。免疫荧光染色结果显示,MCAO组大鼠受损神经元内Ala含量较假手术组明显降低。TTC结果显示,Ala干预使MCAO模型大鼠缺血面积减少(F=83.90,t_(LSD)=3.41,P<0.05)。Western blot结果显示,MCAO模型组大鼠脑组织中PKM2表达水平增高,与假手术组相比差异有显著性(F=3.60,t_(LSD)=5.10,P<0.05),Ala干预后脑组织中PKM2表达水平明显下降(t_(LSD)=6.20,P<0.05)。结论Ala可能通过抑制PKM2蛋白表达减轻脑缺血/再灌注损伤从而发挥神经保护作用。

亮氨酸通过上调糖氧剥夺损伤皮质神经元HIF-1α表达发挥神经保护作用

目的 研究亮氨酸(Leu)对糖氧剥夺(OGD)损伤皮质神经元的神经保护作用以及Leu对低氧诱导因子-1α(HIF-1α)水平的调节。方法 将OGD处理的皮质神经元作为脑缺血体外模型。采用CCK-8比色法、乳酸脱氢酶(LDH)释放实验、台盼蓝染色法检测Leu处理后损伤神经元的存活变化;采用免疫印迹法(Western blot)检测OGD损伤后、Leu处理后神经元中HIF-1α蛋白表达水平;利用DMOG、BAY87-2243分别激动或抑制HIF-1α,观察HIF-1α表达水平对Leu的神经保护作用的影响。结果 OGD损伤后,补充Leu能增加神经元存活率,降低LDH释放率和台盼蓝染色阳性率(F=76.69~236.30,P<0.01)。Leu能上调正常神经元HIF-1α表达水平(t=11.03,P<0.05)。OGD损伤后,神经元中HIF-1α的表达增加(F=183.40,P<0.01)。Leu能上调损伤皮质神经元HIF-1α的表达水平(F=241.80,P<0.01)。HIF-1α水平降低能抑制Leu上调的细胞存活率和下调的LDH释放率、台盼蓝染色阳性率,HIF-1α水平升高能促进Leu上调的细胞存活率和下调的LDH释放率、台盼蓝染色阳性率(F=84.30~320.70,P<0.01)。结论 皮质神经元在OGD损伤后,补充Leu可通过提高HIF-1α表达水平增加神经元存活率。

晚期膝关节骨性关节炎病人血清尿酸水平与性别和年龄的关系

目的探讨晚期膝关节骨性关节炎(KOA)病人血清尿酸水平与性别、年龄的关系。方法以2020年于青岛大学附属医院骨科中心行全膝关节置换手术的1484例KOA病人作为研究对象(男372例,女1112例;年龄40~89岁,平均(66.76±6.52)岁),记录其术前空腹12 h的血清尿酸值,分析不同年龄、性别病人血清尿酸水平的差异。结果女性病人人数约为男性病人的3倍。男性病人血清尿酸水平显著高于女性病人(t=9.705,P<0.05)。50~79岁女性病人占女性晚期KOA病人总数的96.58%,其中以60~69岁年龄段人数占比最高。50~59岁、60~69岁、70~79岁3个年龄段女性病人的血清尿酸水平与40~49岁年龄段病人相比均明显增高,差异具有统计学意义(F=4.553,q=4.597~5.116,P<0.05)。男性病人也以60~69岁年龄段人数占比最高,但各年龄段病人血清尿酸水平变化不明显,且有随年龄增长下降的趋势。结论在女性晚期KOA病人中,患病人数占比较高年龄段的病人血清尿酸水平显著升高,血清尿酸水平可能与女性晚期KOA有关。

褪黑激素对小鼠缺血/再灌注损伤脑组织ATF-6影响

目的探讨褪黑激素(Melatonin)能否通过抑制内质网应激相关蛋白激活转录因子-6(ATF-6)对小鼠脑缺血/再灌注(I/R)损伤发挥保护作用。方法将36只C57BL/6J小鼠随机分为假手术组(Sham组)、I/R组、I/R+生理盐水(NS)组及I/R+Melatonin组,各9只。使用线栓法建立大脑中动脉I/R损伤模型,腹腔注射生理盐水作为I/R+NS组,腹腔注射Melatonin作为I/R+Melatonin组。采用2,3,5氯化三苯基四氮唑(TTC)染色观察各组小鼠脑组织梗死面积,HE染色观察各组小鼠脑组织形态,Western blot法检测脑组织中ATF-6及其下游靶点C/EBP同源蛋白(CHOP)的表达。结果与Sham组相比,I/R组出现明显梗死区域,I/R+Melatonin组梗死面积明显减小(F=30.60,P<0.01);与I/R组相比,I/R+Melatonin组神经细胞排列紊乱和凋亡显著改善,I/R+Melatonin组ATF-6及CHOP表达显著降低(F=56.11、225.50,P<0.01)。结论I/R损伤后,Melatonin通过抑制ATF-6及其下游信号通路CHOP蛋白的表达发挥神经保护作用。

花生四烯酸对大鼠缺血性脑损伤的作用及机制

目的探讨花生四烯酸(AA)是否通过人沉默调节蛋白6(SIRT6)-人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(PTEN)通路对大鼠缺血性脑损伤发挥保护作用。方法构建大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)在体模型和皮质神经元氧糖剥夺(OGD)离体模型。采用蛋白免疫印迹法和免疫荧光染色法检测皮质神经元内PTEN和SIRT6蛋白的表达水平;使用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色观察大鼠脑梗死体积;采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测皮质神经元存活情况。结果MCAO损伤后,补充AA可以减小大鼠脑梗死体积(F=367.80,P<0.05)。OGD损伤后,补充AA可上调皮质神经元SIRT6表达和抑制PTEN表达(F=11.67、14.85,P<0.05),减轻皮质神经元损伤(F=175.40,P<0.05)。给予OSS_128167(SIRT6抑制剂)干预阻断了AA诱导的PTEN表达下调(F=15.63,P<0.05)和神经元存活率增加(F=175.20,P<0.05)。结论AA通过调控SIRT6-PTEN信号通路发挥神经保护作用,改善大鼠缺血性脑损伤。

重组人生长激素对局灶性脑缺血再灌注小鼠运动功能的改善作用及其机制

目的:观察重组人生长激素对局灶性脑缺血再灌注小鼠运动功能的影响,探讨其可能的作用机制。方法:选取C57BL/6J小鼠24只,采用改良Zea-Longa线栓法建立脑缺血再灌注损伤模型,随机分为生长激素治疗组(脑缺血再灌注+生长激素,SG组)和对照组(脑缺血再灌注+生理盐水,SS组),每组12只。SG组小鼠于造模后48 h开始颈部皮下注射重组人生长激素,剂量为1.4 mg·kg^(-1)·d^(-1),持续14 d;SS组小鼠注射生理盐水,注射时间、剂量、部位及次数与SG组小鼠一致。分别于损伤前、损伤后1 d和损伤后16 d,采用平衡木实验评价小鼠运动协调能力,网屏实验评价小鼠肢体肌力,圆筒实验评价小鼠患肢使用率;损伤后16 d,采用免疫印迹法检测2组小鼠梗死灶周围区域中突触蛋白1(SYN1)表达水平。结果:平衡木实验,损伤后1 d,2组小鼠运动协调能力评分均明显低于损伤前(P<0.01);损伤后16 d,2组小鼠运动协调能力评分均高于损伤后1 d(P<0.01),SG组小鼠运动协调能力评分较SS组升高(P<0.05)。网屏实验,损伤后1 d,2组小鼠倒置抓握网屏时的停留时间明显短于损伤前(P<0.01);损伤后16 d,2组小鼠停留时间均优于损伤后1 d(P<0.01);与SS组比较,SG组小鼠倒置抓握网屏时的停留时间明显延长(P<0.05)。圆筒实验,损伤后1 d,2组小鼠患侧肢体使用率明显低于损伤前(P<0.01);损伤后16 d,2组小鼠患侧肢体使用率均高于损伤后1 d(P<0.01),其中SG组小鼠较SS组患侧肢体使用率更高(P<0.05)。免疫印迹法检测,与SS组比较,SG组小鼠梗死灶周围区域中SYN1表达水平明显升高(P<0.05)。结论:重组人生长激素能够改善局灶性脑缺血再灌注小鼠的运动功能,其机制可能与促进梗死灶周围区域中SYN1的表达有关。

PTEN抑制剂Bpv(HOpic)对大鼠缺血脑损伤的作用及机制

目的探讨第10号染色体缺失的张力蛋白同源磷酸酶基因(PTEN)-Jumonji-C结构域蛋白5(JMJD5)信号通路在缺血性脑损伤中的作用,探索潜在的神经保护治疗措施。方法构建大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,Western blot检测缺血损伤脑组织中PTEN和JMJD5蛋白表达水平变化。构建PTEN过表达和干扰模型,Western blot检测脑组织中JMJD5蛋白表达的变化。构建JMJD5过表达和干扰模型,2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色观察脑梗死面积的变化。给予MCAO大鼠PTEN抑制剂Bpv(HOpic),Western blot检测缺血损伤脑组织中JMJD5蛋白水平的变化。通过改良神经功能缺损程度评分(mNSS)评估下调JMJD5表达对Bpv(HOpic)神经保护作用的影响。结果随缺血损伤时间延长,MCAO 3、6、9 h组大鼠脑组织中PTEN蛋白表达水平逐渐升高,JMJD5蛋白表达水平逐渐下降,与假手术组比较差异均有显著性(F=20.70、15.41,t=2.13~7.28,P<0.05)。过表达PTEN后脑组织中JMJD5蛋白水平明显下降,而干扰PTEN表达后JMJD5水平明显升高(F=14.10,t=3.88、2.88,P<0.05)。JMJD5表达上调使脑梗死面积减小,而JMJD5表达下调使梗死面积增加(F=10.58,t=3.92、2.38,P<0.05)。MCAO大鼠给予Bpv(HOpic)处理后损伤脑组织中JMJD5蛋白表达水平增加(t=3.32,P<0.05)。Bpv(HOpic)干预14 d可使MCAO大鼠mNSS得分明显降低,而下调JMJD5表达可阻断此作用(F=4.19,q=6.69、6.16,P<0.05)。结论缺血损伤脑组织中PTEN表达增加,JMJD5表达下降。PTEN抑制剂Bpv(HOpic)可能通过上调JMJD5的表达改善大鼠神经功能缺陷。Bpv(HOpic)调控PTEN-JMJD5信号通路可能是一种潜在的神经保护治疗措施。

醋酸钠对氧糖剥夺损伤后PC12的影响

目的:通过OGD/R处理PC12细胞,证明NaAc在人类缺血性脑卒中中的作用和意义。方法:OGD模型的建立:用无氧糖培养液处理PC12细胞作为脑缺血再灌注损伤的体外模型;使用CCK-8比色法检测OGD损伤后NaAc对PC12细胞的保护状况;使用免疫印迹法Western blot检测OGD损伤后的NaAc对PC12中ATF-6蛋白水平的影响。结果:OGD损伤后,补充浓度为6 mM的NaAc可增加PC12的存活率(n = 6, F = 70.10, P < 0.05);OGD损伤后,PC12中ATF-6的表达升高(t = 2.98, P < 0.05);向正常的PC12细胞补充NaAc后ATF-6表达降低(t = 3.11, P < 0.05);在损伤后的PC12细胞中添加浓度为6 mM的NaAc后,ATF-6的表达水平降低(n = 6, F = 2.09, P < 0.05)。结论:OGD损伤后,PC12中添加浓度为6 mM的NaAc是通过抑制ATF-6的表达来发挥神经保护作用。