一种小粒径壳聚糖纳米粒作为基因载体的研究

系统比较了不同分子量的壳聚糖与TPP离子交联制备的纳米粒,用于基因转运载体,评价其对质粒和siRNA的转运效果。通过粒度仪测定壳聚糖纳米粒(CSNPs)的粒径、多分散系数以及Zeta电位;透射电镜观察CSNPs的形态;MTT法测定其细胞毒性;通过CSNPs在小鼠肌肉内的组织切片观察其生物相容性。CSNPs分别包载质粒和siRNA,凝胶电泳和分光光度法测定其包载能力,荧光显微镜、激光共聚焦或流式细胞术分析其对肿瘤细胞的转染效果;溶血实验和血凝实验分析其血液相容性。结果表明,1 mg/mL的CS(160 k Da)和TPP(质量比为10∶1)制备的CSNPs粒径约100 nm,且分布均一、稳定,透射电镜下为形态规则的类球型粒子;其细胞毒性均在0~1级,符合生物医用材料毒性标准;组织切片没有发现明显的炎症反应,生物相容性良好;CSNPs对质粒和siRNA的包载率较高,并能成功将其转运至细胞内,但小粒径的纳米粒转染质粒后荧光较弱,而携带siRNA的CSNPs转染后荧光较强,且流式细胞术结果表明其与商品化转染试剂相比转染率较高;溶血及血凝实验也发现材料具有良好的血液相容性。所以,制备的小粒径CSNPs更适合作为一种安全高效的siRNA转运载体,后续可以加以修饰应用于肿瘤的基因靶向治疗中。

肾癌细胞PD-L1表达及与肿瘤微环境中T淋巴细胞功能间相互调控关系的研究

目的探讨肾癌中程序性死亡配体1(PD-L1)的表达及与肿瘤微环境中T淋巴细胞功能之间的相互调控作用。方法通过分离人外周血单个核细胞,刺激培养单个CD3^+T淋巴细胞;检测786-O、OSRC细胞系PDL1基因及蛋白表达水平的差异性;ELISA检测外周血T淋巴细胞与786-O、OSRC共培养后γ-干扰素(IFN-γ)的产生水平;通过小干扰RNA下调PD-L1相对高表达的肾癌细胞系与T淋巴细胞共培养后,检测IFN-γ水平的变化;检测786-O、OSRC与T淋巴细胞共培养后PD-L1表达的变化,以及不同浓度IFN-γ对786-O、OSRC中PD-L1表达的影响,分析肾癌细胞系786-O及OSRC中PD-L1的表达与IFN-γ之间的相互调控作用。结果 PD-L1在786-O中的表达水平明显高于OSRC;与单独培养T淋巴细胞相比,与786-O共培养时T淋巴细胞IFN-γ的产生量无明显差异,但与OSRC共培养时T淋巴细胞IFN-γ的产生量明显升高;瞬时干扰降低786-O中PD-L1的表达水平后,与T淋巴细胞共培养,发现T淋巴细胞IFN-γ的产生量较正常共培养组明显升高;共培养体系中T淋巴细胞被激活后两种肿瘤细胞PD-L1的表达明显增高,IFN-γ刺激实验得到相同的结果,且呈剂量依赖性。结论PD-L1高表达的肾癌细胞系可有效抑制外周血T淋巴细胞分泌IFN-γ,导致肿瘤细胞发生免疫逃逸,同时T淋巴细胞分泌的IFN-γ也可以上调肾癌细胞PD-L1的表达,肿瘤微环境中两者存在相互调节作用。

大鼠慢性肺部感染刺激抗中性粒细胞胞质抗体产生及其机制

目的探讨大鼠慢性支气管炎(chronic bronchitis,CB)诱导产生抗中性粒细胞胞质抗体(antineutrophil cytoplasmic antibodies,ANCA)的机制.方法用烟熏法联合气管内注入脂多糖(LPS)诱导建立CB大鼠模型,LPS和佛波酯(PMA)反复刺激CB发作.分为正常对照组(n=5)、对照+PMA组(n=5)、CB组(n=5)、CB+PMA组(n=6).检测4组大鼠肾功能,HE染色观察大鼠肺、肾组织病理变化,ELISA法检测血清中髓过氧化物酶(MPO)-ANCA、蛋白酶3(PR3)-ANCA和中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)标志物瓜氨酸化组蛋白H3(CitH3)的水平.采用Spearman秩相关分析CitH3与MPO-ANCA的相关性.应用免疫荧光染色和激光共聚焦显微镜观察MPO、CitH3在肺脏、肾脏组织的表达和定位.结果(1)CB+PMA组大鼠血清CitH3、MPO-ANCA水平随时间变化均呈上升趋势,第6周末CitH3、MPO-ANCA水平均高于正常对照组、CB组(均P<0.05).大鼠血清CitH3水平与血清MPO-ANCA水平呈正相关(rs=0.490,P=0.024).(2)CB组、CB+PMA组大鼠肺组织存在CB的病理表现,正常对照组、对照+PMA组大鼠肺组织未见明显异常.CB+PMA组大鼠肾脏组织中肾小球内及肾小管周围大量淋巴细胞浸润,炎性细胞黏附于血管壁,但尚未发现肾小球坏死.正常对照组、对照+PMA组和CB组大鼠肾脏组织未见明显异常.(3)CB+PMA组大鼠肺脏、肾脏冰冻组织免疫荧光双染激光共聚焦显微镜可观察到NETs沉积.结论CB大鼠在反复感染过程中,NETs在体内发生蓄积,其所含有的MPO抗原组分反复暴露,最终可导致MPO-ANCA的产生.