数字减影血管造影评价股骨头坏死模型

目的:用数字减影血管造影评价骨膜剥离加髓腔破坏法建立股骨头坏死动物模型的效果。方法:实验于2005-07/2006-01在武汉协和医院中心试验室完成。随机选用成年杂种狗12只,采用骨膜剥离加髓腔破坏法破坏实验动物左侧股骨头的血供,制造股骨头坏死模型,对侧为正常对照。分别于术后1,4,8,16周获取股骨头标本(每个时间点3只动物),制备病理切片进行苏木精-伊红染色观察组织学情况。实验第4周及第16周麻醉后MRI扫描观察股骨头坏死情况。实验动物术前及处死前麻醉后股动脉数字减影血管造影技术检测,比较手术前后股骨头局部的血液循环变化。结果:12只杂种狗均进入结果分析。①病理切片证实全部实验侧标本均出现不同程度股骨头坏死表现,且第16周股骨头标本呈轻度塌陷外观。②狗正常股骨头T1,T2像表现为中低信号影;实验第4周时,造模侧股骨头内表现出散在高信号;第16周时,这些高信号影进一步加大,头下区小片中低信号区。③数字减影血管造影图像显示手术后16周手术区局部出现多量新生血管从股骨颈、髓内等处再生长入有坏死的股骨头内的征象。结论:骨膜剥离加髓腔破坏法能成功建立股骨头坏死模型,且在该模型中存在坏死和重建并存的现象,符合股骨头坏死的病理变化,是一种比较理想的造模方式。

体外构建血管内皮生长因子短发夹状RNA表达载体及其对人骨肉瘤细胞相应因子mRNA及蛋白的抑制

目的:设计并构建血管内皮生长因子短发夹状RNA表达载体,检测其对人骨肉瘤细胞血管内皮生长因子mRNA及蛋白表达的影响。方法:实验于2006-01/07在青岛市市立医院试验中心完成。人骨肉瘤细胞系MG-63购自武汉大学生命科学院;pSilence2.1-neo载体带有U6启动子和neo基因(Ambin公司)。①以人血管内皮生长因子的mRNA序列5’-GATAACGCGGATACCTTGG-3’为靶点,体外构建血管内皮生长因子短发夹状RNA表达载体pSilence2.1-neo-VEGF。②人骨肉瘤细胞MG-63常规培养,消化传代后分为3组:短发夹状RNA载体组转染pSilence2.1-neo-VEGF载体,空载体组转染pSilence2.1-neo载体,空白组无特殊处理。③转染后48h收集各组细胞,采用RT-PCR检测血管内皮生长因子mRNA的表达,免疫组化法检测血管内皮生长因子蛋白的表达。结果:①各组细胞血管内皮生长因子mRNA的表达情况:短发夹状RNA载体组VEGF165mRNA的相对含量显著低于空白组、空载体组(0.181±0.010,1.064±0.019,1.052±0.036,P<0.01),而空白组和空载体组之间差异无显著性意义。②各组细胞血管内皮生长因子蛋白的表达:空白组、空载体组多数细胞中出现明显的棕黄色颗粒状细胞质着色,而短发夹状RNA载体组细胞着色较淡。短发夹状RNA载体组的阳性细胞率显著低于空白组、空载体组[(20.12±2.63)%,(92.45±7.56)%,(91.76±5.26)%,P<0.01],而空白组和空载体组之间差异无显著性意义。结论:pSilence2.1-neo-VEGF可显著抑制人骨肉瘤细胞MG-63血管内皮生长因子mRNA及蛋白的表达,为靶向血管的骨肉瘤基因治疗提供了参考依据。

血管内皮生长因子基因稳定转染兔骨髓基质干细胞的研究

目的检测人血管内皮生长因子（VEGF）基因稳定转染对兔骨髓基质干细胞（BM—SC）VEGF表达的影响。方法分离并培养兔骨髓基质干细胞，利用脂质体介导pcDNA3．1-VEGF165转染兔BMSC，G418筛选稳定表达pcDNA3．1-VEGF165的细胞克隆，RT—PCR、Westernblot法检测转染前后细胞中VEGFl65mRNA和蛋白的表达。结果通过筛选获得了稳定表达pcDNA3．1-VEGF165的细胞克隆。逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、Western blot结果显示：稳定转染组BMSC中可检测到VEGF165mRNA和蛋白的表达，空白和空载体组未见VEGF表达。结论pcDNA3．1-VEGF165载体转染的兔BMSC可稳定表达外源性VEGF165mRNA和蛋白，可作为治疗骨缺损和骨缺血性坏死研究的种子细胞。