数字PCR技术及在病原微生物检测中的应用

数字聚合酶链式反应(digital polymerase chain reaction,dPCR)是继普通PCR和实时荧光定量PCR (quantitative polymerase chain reaction,qPCR)之后的第三代PCR技术,是一项基于单分子目标基因PCR扩增的绝对定量技术。dPCR以微流控和微滴化为基础,将大量稀释后的核酸分散至数百到数万计的微滴中,每个反应室中的单拷贝核酸进行独立的荧光PCR扩增,通过逐个检测并统计反应室中阳性和阴性反应的数量单元,并根据泊松分布的统计学原理进行校正,最终计算出初始样品中目标核酸的精确拷贝数。与传统PCR技术相比,dPCR具有高灵敏度、高精确度、高耐受性和绝对定量的优点。近年来dPCR技术飞速发展,已经广泛应用于生命科学领域。本文对dPCR技术及在感染性疾病病原微生物检测方面的应用进行了综述。

2015—2017年度青岛口岸输入性流感监测分析

目的对青岛口岸输入性流感病例的流行病学特征进行分析,为流感的监测及其疫情防控提供依据。方法2015—2017年采集青岛口岸有咳嗽、咽痛、发热(体温≥37℃)等症状的入境人员的鼻咽拭子样本,采用实时荧光RTPCR法对样本进行流感病毒核酸检测和分型。运用描述流行病学方法对流感病例及流感病毒病原学监测数据进行分析。结果 2015—2017年,青岛口岸对1 612名疑似上呼吸道感染的入境人员采集了鼻咽拭子,检出流感病例308例,阳性率为19.11%。3个监测年度青岛口岸入境人群流感发病率分别为6.41例/10万,3.75例/10万和8.53例/10万,流感病例均呈冬春季高发的季节性变化。3个监测年度均为甲型H3N2、H1N1(2009)流感和乙型流感共同流行,2017年12月—2018年2月输入性流感检出率达到近3年最高,Yamagate系乙型流感病毒是2015和2017监测年度主要的乙型流感病毒流行株。检出的流感病例主要来自韩国、日本和泰国,分别占总病例的37.66%、21.10%、12.01%。男性发病率明显高于女性,不同性别检出率差异有统计学意义。结论 2015—2017年,青岛口岸输入性流感为甲型H3N2流感、H1N1(2009)流感和乙型流感交替流行,与全球流感监测网络公布的数据一致。

青岛口岸入境货物中截获输入性东亚异蚤蝇

目的对青岛机场海关截获的1批入境成蝇和蝇蛹进行形态和DNA条形码鉴定。方法对截获的蝇类,先进行形态学鉴定,然后取蝇的1条足及1只蛹分别提取基因组DNA,利用DNA条形码技术,对该未知蝇类基因组DNA进行扩增和序列分析,与美国国立生物技术信息中心(NCBI)GeneBank数据库及生命条形码系统(BOLD)中的序列进行比对,构建进化树。结果形态学鉴定为双翅目蚤蝇类,通过DNA条形码鉴定和序列比对,成蝇及蛹的DNA条形码序列与GenBank和BOLD中东亚异蚤蝇的序列同源性>99.00%,结合形态学鉴定结果,判断该蝇种成虫及蛹为东亚异蚤蝇。结论所捕获的蝇类成虫与蛹为东亚异蚤蝇,为青岛机场海关首次在入境货物中发现。

青岛未见分布蝇种—天仙子泉蝇的鉴定

目的对青岛胶东国际机场捕获的2只蝇类进行形态和DNA条形码鉴定。方法对捕获的蝇类,先进行形态学鉴定,然后利用DNA条形码技术,以COI基因为目的基因进行扩增和测序,分析物种同源性并构建系统进化树。结果2只蝇类样本形态学鉴定为花蝇科,无法鉴定到种。通过DNA条形码鉴定和序列比对,2只蝇样本的序列与BOLD数据库中天仙子泉蝇Pegomya hyoscyami的COI基因上一段长达658 bp的序列同源性高达100%,判断为天仙子泉蝇。结论在青岛机场捕获的蝇类为天仙子泉蝇,是青岛口岸首次发现。

SYBR Green Ⅰ染料法荧光RT-PCR鉴别乙型两系流感病毒

目的建立SYBR GreenⅠ染料法荧光RT-PCR快速鉴别乙型流感病毒Yamagate系和Victoria系。方法比对乙型流感病毒Yamagate系和Victoria系的HA基因,设计特异性引物,采用SYBR GreenⅠ染料法荧光RT-PCR扩增两系病毒,进行熔解曲线分析,测定各系扩增产物的熔解温度。优化反应体系及条件,进行特异性、灵敏性及重复性评价。结果熔解曲线分析结果显示,乙型流感病毒Yamagate系和Victoria系扩增产物的熔解温度相差较大,Yamagate系为80.40℃,Victoria系为79.04℃。特异性实验表明,该方法能检测乙型流感病毒,与甲型流感病毒、冠状病毒HCoV-229E、HCoV-0C43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1等呼吸道病毒没有交叉反应。灵敏性实验表明,该方法对Yamagate系和Victoria系乙型流感病毒最低检测限均为102拷贝/μl。对105份乙型流感病毒阳性鼻咽拭子样本的检测结果与WHO的TaqMan探针法完全一致。结论建立的SYBR GreenⅠ染料法荧光RT-PCR方法可快速检测乙型流感病毒并对两系乙型流感病毒进行鉴别。

重组酶聚合酶扩增方法快速检测志贺菌

目的建立一种重组酶聚合酶扩增(RPA)方法检测志贺菌。方法依据志贺菌属侵袭性质粒抗原H(ipaH)基因的保守序列设计特异性引物,建立RPA检测方法;通过检测梯度稀释的志贺菌标准菌株DNA,评价RPA的灵敏度;通过检测志贺菌、出血性大肠埃希菌O157:H7、沙门菌、副溶血弧菌、粪肠球菌评价RPA的特异性。结果建立的RPA方法在35℃反应20min,即可检测到志贺菌ipaH基因,检测灵敏度为10ng/μl志贺菌基因组DNA,比PCR高100倍;且与其他肠道病原菌无交叉反应。结论本研究建立的志贺菌RPA检测方法敏感性、特异性强,操作简单快速,为志贺菌的现场快速检测提供一种新思路。