冬季刺参养殖环境与肠道内细菌菌群的研究

运用传统细菌分离培养与分子生物学技术相结合的方法,对2008年11月至2009年1月冬季刺参(Apostichopus japonicus Liao)养殖池塘环境(养殖水、底泥、附着基)及刺参肠道内的细菌菌群进行了分析。应用平板稀释涂布培养计数法测得刺参养殖池塘水体、底泥、附着基和肠道细菌数量分别为0.75×102～1.4×104cfu/mL、8.7×104～8.1×105cfu/g、3.8×105～2.8×106cfu/g、7.1×105～1.5×107cfu/g;根据形态学差异从培养所得的细菌中筛选得到22株菌,用限制性内切酶Rsa I和Msp I对所分离菌株进行ARDRA(Amplified rDNA Restriction Analysis)分析,这22株菌被分为8种不同的分类单元(Operational Taxonomic Unit,OTU),其中OTU2与OTU3所包含的菌株分别占分离菌株种数的30%和20%;此外,作者对不同环境培养所得的优势度最高的细菌进行分子鉴定分析。结果表明:水环境中优势菌为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)及巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium),沉积物中优势菌为巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis),附着基中优势菌为巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis),灿烂弧菌(Vibrio splendidus),肠道中优势菌为巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis),灿烂弧菌(V.splendidus)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)。通过对冬季刺参池塘细菌菌群多样性分析和优势菌鉴定,为筛选低温益生菌和防治刺参疾病提供了有益参考。

乳酸菌及其代谢产物对刺参幼体肠道菌群和非特异性免疫的影响

以初始体质量为(2.74±0.17)g的刺参(Apostichopus japonicus)为研究对象,在室内养殖池进行60 d饲喂实验,研究饲料中添加乳酸菌制剂和乳酸菌代谢产物对刺参肠道菌群、部分免疫指标及生长的影响。在基础饲料中分别添加乳酸菌制剂和乳酸菌代谢产物各2 mL/m3(按饲养水体折算),配制2种实验饲料。实验结果显示:与对照组比,饲料中添加乳酸菌与乳酸菌代谢产物均显著降低了刺参肠道弧菌数及大肠杆菌数(P<0.05);饲料中添加乳酸菌及其代谢产物能使刺参肠道酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活力显著升高,溶菌酶活性有所提升,其中乳酸菌制剂实验组与代谢产物实验组免疫酶活力差异不显著;两实验组刺参的特定生长率显著高于对照组(P<0.05)。上述结果表明,乳酸菌制剂与乳酸菌代谢产物对刺参的肠道菌群平衡、免疫力及生长均具有良好的促进作用,且两者之间差异不显著。

刺参肠道与养殖池塘环境中异养细菌和弧菌数量周年变化

2008年9月～2009年10月，对刺参肠道与养殖环境中异养细菌和弧茵周年变化进行了初步研究。结果表明：刺参肠道与养殖环境中（水体、底泥、附着基）异养细菌数（HPC）、弧菌数（VBC）均呈现出明显的季节变化，肠道中HPC、VBC分别为1．85×105～2．17×109CFU／g、4．1×104-2．2×108CFU／g，水体中HPC、VBC分别为90～4．67×105CFU／mL、0～5_3×100CFU／mL，底泥中HPC、VBC分别为9．80×104-6．72×106CFU／g、1．01×104～5．75×105CFU／g，附着基中HPC、VBC分别为2．78×105-2．57×107CFU／g、4．6×104-1．31×107CFU／g，夏、秋两季细菌总数较高，冬、春低温季节细菌数量显著下降。通过VBC与HPC的比值可以看出，在冬、春季细菌总数较低的季节，弧菌与异养细菌数量比例较高，最高值达到：43．8％、43．2％，通过对优势菌的分离鉴定，冬、春两季灿烂弧茵（Vibriosplendidus）均占优势，这可能是造成冬、春两季刺参发病的诱因之一。本文通过研究刺参肠道与养殖环境中异养细菌和弧茵的变化规律，以期为刺参的健康养殖提供有益参考。

全营养破壁酵母对仿刺参非特异性免疫及肠道菌群的影响

仿刺参(Apostichopus japonicus)体质量(0.65±0.03)g,基础饲料中添加5%(质量分数)全营养破壁酵母为实验饲料,以基础饲料为对照。分别于投喂后第15天和第30天检测仿刺参体腔细胞数量、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、过氧化氢酶(CAT)活性,于第30天计数肠道菌群。结果显示,实验组仿刺参体腔细胞数量与对照组差异不显著;ACP、AKP、CAT活性均比对照组有所增高,其中第15天CAT活性和第30天AKP活性与对照组具有显著性差异(P<0.05)。投喂破壁酵母对仿刺参肠道菌群有一定影响,可显著降低肠道内异养菌总数及弧菌数量。研究表明,全营养破壁酵母对仿刺参非特异性免疫活性有增强作用,且对肠道有害菌群有一定抑制作用,但其对肠道菌群的影响及适宜添加量等需进一步研究。本研究旨在探索全营养破壁酵母在海参育保苗中的作用机理,以期为仿刺参安全健康养殖开发新型绿色添加剂提供科学依据。

刺参池塘养殖系统中发酵饲料的制作与投喂

将海带粉、扇贝边粉、豆粕、虾粉、马尾藻粉按照40∶18∶20∶7∶15的配比混合,经浸泡、研磨等预处理后,加入0.25%～0.5%的水产诱食酵母,发酵72h。SDS-PAGE凝胶电泳结果显示,经过发酵处理后,饲料中的大分子蛋白发生降解。按照刺参体重3%的投喂量进行为期50d的投喂实验,结果表明,发酵饲料组刺参的生长明显优于普通饲料组(未发酵饲料),可见发酵饲料能够更好地满足刺参健康、快速生长的需要,具有良好的市场潜力。

浒苔添加比例与微生物发酵对幼刺参生长、消化和非特异性免疫的影响

为探究浒苔添加比例与微生物发酵对幼刺参生长、消化和非特异性免疫的影响,试验以浒苔、马尾藻、石莼、扇贝边等为原料,配制成浒苔添加比例分别为0、10%、20%、30%和40%的5种饲料。将每种饲料均分成2份,其中1份利用酿酒酵母菌发酵,试验最终得到10种试验饲料。将上述饲料饲喂初始平均体重为（3.94±0.46）g的幼刺参46 d,每种饲料设3个重复,每个重复投喂30头幼刺参。结果表明：1）随着浒苔添加比例的提高,在未发酵组中幼刺参的增重率（WGR）、特定生长率（SGR）和饲料效率（FE）有升高的趋势,以40%添加组最优;在发酵组中幼刺参的WGR、SGR和FE先升高后降低,以30%添加组最优。添加30%与40%的浒苔对W GR、SGR和FE的影响差异不显著（P〉0.05）,但二者均显著高于添加10%的浒苔（P〈0.05）。而发酵与否对各项生长性能指标均无显著影响（P〉0.05）。2）在未发酵组中,随着浒苔添加比例的提高,肠道纤维素酶活力呈现出先上升后下降的趋势;而在发酵组中,肠道纤维素酶活力呈现出不断上升趋势。同一添加比例下,发酵组的肠道纤维素酶活力要高于未发酵组,且在添加比例为10%、20%、40%时差异显著（P〈0.05）。浒苔添加比例和发酵与否之间的交互作用除对肠道纤维素酶活力有显著影响（P〈0.05）外,对肠道胰蛋白酶和淀粉酶活力均无显著影响（P〉0.05）。3）浒苔添加比例与发酵与否对幼刺参体腔液中酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）和超氧化物歧化酶（SOD）活力均无显著促进作用（P〉0.05）,且二者无显著交互作用（P〉0.05）。由此得出,幼刺参饲料中浒苔的适宜添加比例在30%-40%之间;对添加浒苔饲料的进行微生物发酵可以适当提高幼刺参肠道中纤维素酶活力。

秋、冬季节刺参养殖池塘浮游细菌数量变化规律的研究

应用平板稀释涂布培养计数法和荧光显微镜计数法,对秋、冬季(2008年9月～2009年2月)刺参养殖池塘水体中的浮游细菌数量变化规律进行了分析。结果表明,吖啶橙染色直接计数法(AODC)测得细菌总数的变化范围是1.0×106～2.1×107个/ml,活菌直接计数法(DVC)测得活菌总数的变化范围是4.0×105～5.7×106个/ml。异养细菌平板计数法(HPC)测得异养细菌数量为0.6×102～1.7×105CFU/ml。TCBS平板培养的弧菌数量在6.6×103CFU/ml以下。从时间分布看,刺参养殖池塘水体中浮游细菌数量最高值出现在10月份,最低值出现在1月份,秋季细菌数量显著高于冬季(P<0.01)。从空间分布看,水体底层细菌数量显著高于表层(P<0.05)。利用SPSS13.0软件对所得到的数据进行统计分析表明,同一样品不同计数方法获得的细菌总数数值之间存在显著的相关性(P<0.01)。

不同浒苔型饲料对幼刺参(Apostichopus japonicus)生长、消化及非特异性免疫的影响

以浒苔、石莼、豆粕、扇贝边、葡萄糖、贝壳粉、维生素和矿物质预混料为原料配制刺参(Apostichopus japonicus)饲料,利用酿酒酵母菌菌液和碱性蛋白酶制剂对刺参饲料进行4种不同的处理,得到5组实验用饲料,分别为对照组、发酵组、酶解组、复合组和鲜浒苔组。将上述饲料饲喂初始体重为(1.92±0.02)g的幼刺参42 d,每种饲料设3个重复,每个重复30头幼刺参。结果显示,不同的浒苔型饲料对幼刺参的存活率(SR)、增重率(WGR)、特定生长率(SGR)和饲料系数(FC)有显著影响(P<0.05),而对其脏壁比(R)无显著性影响(P>0.05)。复合组和鲜浒苔组SR要显著高于酶解组(P<0.05),而与其他2组均无显著性差异(P>0.05)。鲜浒苔组WGR远高于其他各组(P<0.05),而复合组和发酵组WGR显著高于酶解组(P<0.05),与对照组差异不显著(P>0.05)。幼刺参的SGR规律与WGR一致。鲜浒苔组FC显著低于对照组、发酵组和酶解组(P<0.05),与复合组差异不显著(P>0.05)。随着摄食饲料时间的推移,对照组、发酵组、复合组和鲜浒苔组淀粉酶(AMS)活力先升高再下降后趋于稳定,而酶解组一直呈现下降趋势。酶解组纤维素酶(Cellulase)活力呈现一直下降的趋势,而其他组呈现波动变化,且均高于初始活力值。随着摄食饲料时间的推移,除酶解组外,其余各组胰蛋白酶(TRY)活力前后时间点变化差异不大,且每个采样点幼刺参TRY活力大小顺序始终是对照组>复合组>鲜浒苔组>发酵组>酶解组。不同浒苔型饲料饲喂的幼刺参体腔液中酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)和超氧化物歧化酶(SOD)活力均有显著性差异(P<0.05)。鲜浒苔组ACP活力最大,且与复合组无显著性差异(P>0.05),而显著高于其他3组(P<0.05)。鲜浒苔组和复合组AKP活力显著高于酶解组和对照组(P<0.05),与发酵组无显著性差异(P>0.05)。复合组SOD活力最大,且显著高于发酵组和酶解组(P<0.05),而与对照组和鲜浒苔组均无显著性差异(P>0.05)。由此得出,幼刺参在摄食先酶解后发酵的饲料后能够得到良好的生长效果,并可改善自身肠道消化,维持正常免疫。这为解决刺参饲料原料短缺以及浒苔高值化利用提供了依据和方法。

池塘养殖仿刺参(Apostichopus japonicus)肠含物、附着基和底泥中的菌群结构及其相关性

2014年10月,利用PCR-DGGE技术分析了标准化养殖池塘中仿刺参(Apostichopus japonicus)肠含物及附着基和底泥中细菌的菌群结构及其相关性。结果显示,仿刺参肠含物、附着基、底泥中细菌多样性较高,分别平均获得30.00±1.00、15.33±1.70、21.67±2.62条带,肠含物中细菌种类数显著高于附着基和底泥。聚类分析和戴斯系数表明,不同池塘的仿刺参肠含物样本单独聚为一支,相似性达到0.785,附着基和底泥样品聚为一支,平均相似性达到0.532。不同样品DGGE图谱中20条优势条带的切割、克隆、测序,共获得了20条细菌序列,表明肠含物细菌种类以聚球藻属(Synechococcus sp.)、脱硫杆菌属(Desulfobacterium)、脱硫叠球菌属(Desulfosarcina sp.)、极地杆菌属(Polaribacter)、Algibacter sp.为主,附着基中主要以Robiginitalea sp.和Silicibacter sp.为主,底泥样品中主要以假单胞菌属(Proteobacterium)、噬胞菌属(Cytophaga)、Desulfosarcina sp.为主,肠含物中细菌特有种类的分离与鉴定为仿刺参养殖潜在益生菌的开发提供基础数据。

底部微孔增氧管布设距离和增氧时间对刺参养殖池塘溶氧的影响

为明确刺参养殖池塘中微孔增氧的效果以及增氧管的布设间距、增氧时间对水体溶氧的影响,研究测定了在夏季刺参养殖池塘一个增氧周期内(每天23:00—7:00增氧8 h,7 d一个周期)水体中溶氧(DO)、亚硝酸盐氮(NO_2^--N)、COD的变化。结果显示:连续充气增氧的8 h内DO持续增加,增氧2 h上升速率缓慢,增氧2~6 h上升速率迅速提高,增氧6~8 h上升速率下降,连续充气8 h能够显著改变夜间溶氧降低现象;增氧7 d时间内,NO_2^--N和COD持续下降,分别由0.025 mg/L下降到0.014 mg/L、18.46 mg/L下降到14.15 mg/L。对充氧管道不同距离处DO的测定结果表明,距离增氧管1~2 m处DO较高,3~4 m处缓慢下降,与1~2 m处差异不显著(P>0.05),DO保持在5.22 mg/L左右,距离5 m以上时DO下降速度较快,与1~2 m处差异显著(P<0.05)。研究表明:微孔增氧可以明显增加水体DO,减少COD、NO_2^--N;微孔增氧机充氧时间6~8 h效果较好;微孔增氧管之间的布设距离在6~8 m可以实现高效增氧。

一种中草药复方对刺参苗期玻璃海鞘的杀除效果

用使君子、雷丸、茶籽饼、川楝子、大蒜素、矿物质分散剂组成中草药复方，分别以0、5、6、8、10、15、20和25mg·L-1的浓度对刺参苗期玻璃海鞘（Ciona intestinalis）进行杀除效果和对刺参苗种的毒性试验，以研究中草药复方对海参苗期玻璃海鞘的杀除效果。结果表明：：果用该中草药复方，浓度为10～15mg·L-1时，药浴24h，既能有效杀灭玻璃海鞘，又对稚参无毒副作用，对养殖水体各指标也基本无影响，是刺参养殖系统中杀灭玻璃海鞘的最适浓度。进一步的生产性应用实践表明，在刺参育苗池中采用“3＋7”模式（用药后第3d倒池、第7d倒板）施用浓度10—15mg·L-1的中草药复方，可达到杀除玻璃海鞘的良好效果，且与海参容易分离。在上述药物浓度作用下，刺参苗种伸展、附着和摄食正常，健康状况良好。该中草药复方适合在生产实践中应用推广。

刺参苗期附着基更换频率对刺参生长及其养殖系统菌群结构的影响

为了探究刺参（Apoasichopus japonicus）保苗阶段（7–9月）最佳的附着基更换频率（changing frequency,CF）,本实验在夏季保苗期设置5个附着基更换频率组,即CF10、CF20、CF30、CF40和CF50。采用实验生态学的方法,并结合传统细菌培养法和16S r DNA细菌鉴定技术对上述不同实验组进行检测。结果表明：CF20组刺参整池增重和个体增重幅度最大,CF30次之,CF50组由于死亡率高,整池重量为负增长。CF20组的特定生长率和存活率分别为（5.986±0.135）%/d和（95.231±0.265）/%,且显著高于其他各组（P〈0.05）,CF30次之,而CF_（50）组的特定生长率和存活率最低,且显著低于其他各组（P〈0.05）。养殖用水中4NH＋-N、2NO--N和COD随着附着基更换频率的降低而升高,并在第50天时分别达到0.53 mg/L、0.28 mg/L、0.18 mg/L。各实验组水体中异养细菌和弧菌数量随附着基更换频率变化不明显,而附着基上的异养细菌和弧菌数量随附着基更换频率的降低而升高,CF_（50）组异养细菌总数在第50天时达到1.38×10^5 cfu/cm^2,弧菌数量达到1.5×10^4 cfu/cm^2,皆明显高于其他各组。附着基上优势菌为溶藻弧菌（Vibrio algindyticus）、需钠弧菌（V.natriegens）、马胃葡萄球菌（Staphylococcus equorum）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、苏云金芽孢杆菌（B.thuringiensis）和副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）。其中,溶藻弧菌为刺参条件致病菌,且一直存在于养殖系统中并逐步占据绝对优势。这与CF_（50）组在实验进行到43 d时开始出现化皮,50 d时开始出现死亡现象有一定的关系。同时,附着基长时间未更换,会滋生大量玻璃海鞘、日本毛壶、内刺盘管虫等敌害生物,争夺栖息空间和食物,导致刺参苗种生长减慢。综上,由实验结果显示,在7–9月高温季节每20 d更换一次附着基最佳。考虑到生产成本,附着基更换频率一般为20~30 d为宜。本研究结果为刺参苗种培育工艺的优化及刺参健康养殖提供了理论依据和参考。

饥饿胁迫对刺参(Apostichopus japonicus)免疫和生长的影响

为了探究饥饿胁迫对刺参免疫和生长的影响,在11?13℃条件下,研究体质量为(20±0.15)g的刺参在不同时间(0、10、20、30、40、50、60 d),饥饿胁迫对体腔液中酸性磷酸酶(ACP)活性、溶菌酶(LZM)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、呼吸爆发(RB)活性、吞噬活性以及对刺参体质量、脏壁比、存活率的影响。研究结果表明,随着饥饿时间的延长,刺参体腔液中的ACP活性、LZM活性呈现降低的趋势,饥饿60 d后,比初始值分别下降47.06%、17.57%;SOD活性、RB活性和吞噬活性呈现出先上升后下降的趋势,分别在饥饿胁迫第20、20、10天时达到最高值依次为32.88、0.328、1.35 U/ml,其后显著下降,第60天时显著低于初始值,分别下降27.87%、38.08%、53.43%;其体质量在第60天时为初始体质量的68.08%,呈现负生长;脏壁比逐渐增大,第60天时为0.56,显著高于初始值0.44(P<0.05)。随着存储营养物质的消耗,刺参体质量损失率增加,存活率下降,存活率与体质量损失率之间存在着y=?0.0354x2+0.4354x+99.117的函数关系,呈二次曲线线性负相关。研究结果显示,饥饿时刺参通过消耗体内的营养物质来满足机体需要,长期的饥饿有可能降低刺参的免疫能力,直接影响刺参的健康和生长。

饲料中添加凝结芽孢杆菌对凡纳滨对虾生长、血清非特异性免疫指标及抗病力的影响

通过42天饲喂添加有不同浓度凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)NJ1701(5.0×10~9、1.0×10^(10)、5.0×10^(10)和1.0×10^(11)cfu/kg)的对虾饲料,研究凝结芽孢杆菌对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)幼虾生长、血清非特异性免疫指标和对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)抗病力的影响。研究表明:各组对虾的成活率均在90%以上,各处理组间差异不显著(P>0.05)。与对照组相比,各处理组凡纳滨对虾的体重、特定生长率、饲料效率和表观消化率均显著提高(P<0.05),其中以凝结芽孢杆菌添加浓度5.0×10~9~1.0×10^(10)cfu/kg时效果较佳。不同凝结芽孢杆菌添加浓度对对虾血清非特异性免疫酶活性影响的差异较大。其中,1.0×10^(10)cfu/kg添加浓度下,对虾血清中溶菌酶(LSZ)、总一氧化氮合酶(TNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性显著高于对照组(P<0.05),而5.0×10^(10)cfu/kg添加浓度下,对虾血清的酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(ALP)活性显著高于其他处理组和对照组(P<0.05)。添加凝结芽孢杆菌不影响血清超氧化物歧化酶(SOD)活性,血清iNOS活性则随添加浓度的提高而升高,以1.0×10^(11)cfu/kg添加水平下最高。副溶血弧菌攻毒后,5.0×10~9和1.0×10^(11)cfu/kg处理组(分别为40.0%和13.3%)对虾累计死亡率显著低于对照组(66.7%)(P<0.05),但1.0×10^(10)和5.0×10^(10)cfu/kg处理组(53.3%)与对照组差异不大(P>0.05)。各处理组间比较,以1.0×10^(11)cfu/kg处理组对虾累积死亡率最低。研究结果表明,饲喂凝结芽孢杆菌可有效促进凡纳滨对虾的生长,提高其血清非特异性免疫水平和对副溶血弧菌的抗病力。以特定生长率为评价指标,凝结芽孢杆菌的适宜添加量为1.0×10^(10)cfu/kg。

三种不同乳酸菌对凡纳滨对虾生长、抗病力及肠道菌群结构的影响

本研究比较了饲料中添加粪肠球菌(Enterococcus faecalis LYB1)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus W2)和凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans NJ17)对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)幼虾的生长、抗病力及肠道菌群结构的影响。以基础饲料中分别添加1.0×1010 cfu/kg浓度的3种不同乳酸菌为实验组,以基础饲料为对照组,以投喂方式养殖对虾42 d。养殖结束后,进行14 d的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)攻毒实验。研究表明:投喂3种乳酸菌的实验组对虾的体重、特定生长率、饲料效率和表观消化率均显著高于对照组(P<0.05),其中以添加凝结芽孢杆菌组效果最佳。攻毒实验显示,添加粪肠球菌和嗜酸乳杆菌均可显著降低对虾的累计死亡率(P<0.05)。添加乳酸菌的各实验组对虾的肠道细菌群落结构与对照组相比均发生了明显变化,其中以添加粪肠球菌组差异最大。在门水平上,变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为对虾肠道优势菌群。在纲分类水平上,α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、丹毒丝菌纲(Erysipelotrichia)和黄杆菌纲(Flavobacteriia)为对虾肠道优势菌群。研究结果显示,凝结芽孢杆菌NJ17对凡纳滨对虾促长效果最佳,而嗜酸乳杆菌W2对对虾抗病力提高效果最佳,3种乳酸菌均明显改善了对虾肠道微生物群落的组成和丰度。

不同类型附着基对刺参栖息趋向性的影响分析

利用单位体积平均聚集数量(Average Gathered Number of Unit Volume,AGNUV)和平均聚集率(Mean Attractive Rate,MAR)统计分析了刺参对10种附着基(石块、三角瓦、U形瓦、遮阳网、网笼附着基、竹制附着基、三孔砖、涡流式异形瓦、大多棱瓦、小多棱瓦)和8种栖息分布区域(池壁面、池棱角、池底面、附着基上、附着基下、附着基棱角凹槽处、附着基内、附着基外)的选择趋向差异性。结果表明,不同类型附着基诱集刺参的效果为:大多棱瓦>石块>三孔砖>小多棱瓦>U形瓦>涡流式异形瓦>三角瓦>网笼附着基>遮阳网>竹制附着基,且大多棱瓦集参效果与三角瓦、网笼附着基、遮阳网、竹制附着基、涡流式异形瓦差异极显著。本研究还发现刺参在水泥池棱角处的MAR(21.02%)高于池壁面MAR(8.23%)和池底面的MAR(15.68%);刺参在附着基下方和附着基内部的MAR分别高于在附着基上方和附着基外部的MAR。此外,实验结果也表明,1)大多棱瓦附着基对刺参具有最佳诱集效果;2)刺参对栖息位置具有选择趋向性,且不同时间刺参对栖息位置的选择存在显著性差异;3)石块、网笼附着基、遮阳网不宜作为附着基。

刺参4个不同选育品系幼参对低盐胁迫的耐受及生理生化响应

由于黄河口区域盐度偏低且不稳定,刺参(Apostichopus japonicus)的生长和存活受到严重威胁。为评估4个不同品系(日本刺参F2代RC-F2、抗病刺参F3代KC-F3、多刺刺参F2代DC-F2、青青刺参F1代QQ-F1)的低盐耐受力及其生理生化响应,本实验以青岛野生群体(QW)为对照,通过测定低盐胁迫下幼参的生长、存活以及非特异性免疫酶活力变化,评价了4个刺参不同选育品系对低盐的耐受状况。结果表明,在盐度17以下,除了QQ-F1表现为正生长,其他群体均为负生长。RC-F2、KC-F3、DC-F2、QQ-F1和QW的30天半致死盐度(LS50-30d)分别为15.02、15.19、16.48、14.26和15.13,QQ-F1显著低于其他4个群体;盐度14时,5个群体的半致死时间(ST50)分别为19.84 d、18.43 d、10.11 d、23.54 d和19.01 d,QQ-F1的ST50显著长于其他4个群体。在低盐胁迫时QQ-F1的ACP、AKP、SOD、LZM酶指标的下降幅度显著低于其他4个群体。不同选育群体的低盐耐受力排序为QQ-F1>RC-F2>QW>KC-F3>DC-F2,QQ-F1群体表现出良好的低盐耐受能力,在低盐度海域或盐度不稳定的海域具有良好的推广应用前景。本实验研究结果可为刺参健康养殖、良种性状评价、选育与推广等方面提供参考依据。

刺参养殖池塘中一株植物乳杆菌的分离及其生物学特性

2017年5月,从山东东营刺参(Apostichopus japonicus)养殖池塘底泥中分离获得49株乳酸菌。以刺参"腐皮综合征"的2株致病菌[灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)]为指示菌进行拮抗作用实验,获得1株具有显著抑菌活性的乳酸菌CLY-5,对该菌株进行了生理生化实验、16S rDNA序列分析、生长特性及其对刺参的安全性研究。结果显示,菌株CLY-5对灿烂弧菌和假交替单胞菌具有较好的抑制作用,且菌株的胞内产物与胞外产物均具有抑菌效果,抑菌圈分别为20、23 mm和27、38 mm,胞外产物的拮抗作用优于胞内产物。利用该菌对刺参进行高浓度浸浴测试其安全性,浓度为1×10^9、1×10^8和1×10^7 CFU/ml,实验期间刺参状态良好,无死亡现象。16Sr DNA序列分析表明,CLY-5与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum NR117813.1)的相似性为100%,初步鉴定该菌株为植物乳杆菌。菌株CLY-5在30℃~44℃、pH6~8范围内生长较快,20 h进入对数生长期,28~32 h达到生长高峰。筛选的植物乳杆菌具有良好的抑菌能力,且其生长特性适应刺参池塘的养殖环境,为刺参疾病的生态防控及乳酸菌资源的开发提供应用数据参考。

养殖刺参早期发育阶段体内可培养细菌的菌群特征及其与环境菌群相关性分析

采用传统细菌培养方法,对养殖刺参(Apostichopus japonicus)早期发育各阶段幼体体内及环境(投入饵料及培育用水)菌群的组成与结构展开研究,对分离的优势细菌进行分子鉴定,在此基础上,进行了刺参幼体体内菌群结构与环境菌群结构相关性分析。幼体各发育期的细菌培养结果显示,在幼体开口前的各发育时期(性腺、卵、受精卵、原肠胚)均无可培养细菌,在投饵以后,耳状幼体、樽形幼体体内可分离到可培养细菌,幼体发育到稚参以后,消化道可培养细菌总数急剧增加,并在4月龄时达到10~8 CFU/g数量级。在幼体体内可培养细菌中,弧菌(Vibrio)占比为2.2%～77.3%。对环境菌群的细菌培养结果显示,培育用水中细菌含量变化不显著,随着幼体发育期饵料的转变,不同时期饵料中细菌含量差异显著。整个养殖系统中共分离到65株优势细菌,16S rDNA鉴定结果显示,所分离的65株优势菌鉴定为14个属43种细菌。相关性分析结果显示,随着幼体的发育,生物饵料中的细菌对消化道中的菌群结构影响越来越大。本研究结果为解析刺参消化道菌群的形成过程和演替规律以及养殖用益生菌的筛选与应用奠定了基础。

刺参(Apostichopus japonicus)重要经济性状相关SNP标记的验证分析

本研究在前期构建的刺参(Apostichopus japonicus)高密度遗传连锁图谱和QTL分析的基础上,筛选出26个与体长、体重、体宽、棘刺总数、抗病力相关的SNP位点,设计出可用于HRM检测的SNP扩增引物13对。在扩大群体中利用HRM小片段法对这13个刺参重要经济性状相关的候选SNP位点进行分型和多态性检测,并结合扩大群体的相关性状数据进行了QTL位点验证。多态性结果显示,13个位点中有3个单态性位点,其余10个多态性位点中有3个位点为低等位多态性,7个位点为中等位多态性。10个多态性位点的最小等位基因频率(MAF)介于0.016(SNP113)～0.332(SNP160)之间,平均值为0.173;各位点的观测杂合度(Ho)介于0.031(SNP113)～0.818(SNP9)之间,平均值为0.433;期望杂合度(H_o)介于0.031(SNP113)～0.834(SNP9)之间,平均值为0.402;多态信息含量(PIC)介于0.030(SNP113)～0.393(SNP160)之间,平均为0.248,有6个位点偏离HardyWeinberg平衡。QTL验证结果表明,SNP40和SNP160位点为与生长(体长、体重、体宽)相关的位点,各位点的优势基因型分别为SNP40(CC)和SNP160(AA);SNP88、SNP112和SNP126这3个位点为与抗病力相关的位点,各位点的优势基因型为SNP88(CC)、SNP112(AA)和SNP126(TT)。基于这5个位点构建生长和抗病二倍型,发现二倍型K_1(CC AA TT)抗病力最强,S_1(CC AA)、S_3(CC AC)在生长方面优势显著,相关研究结果可为分子标记辅助育种在生产中应用提供基础数据。