聚乙烯醇固定化胆固醇氧化酶的研究

【目的】探讨类芽孢杆菌胆固醇氧化酶(COD)的固定化,为COD的应用研究提供参考依据。【方法】以不同浓度的聚乙烯醇、硼酸为主要材料制备固定化酶,并通过试验确定制备固定化酶的最适浓度、最佳反应温度、最适pH、热稳定性、酸稳定性、米氏常数及操作稳定性。【结果】选用12%聚乙烯醇、5%硼酸制备的固定化酶形状好、强度适中、易操作、固定化率高,其最适反应温度60℃,最适反应pH7.0,热、酸稳定性比游离酶好,且稳定范围较游离酶宽,表观米氏常数Km(2.55×10-5mol/L)相对游离酶变小,重复使用5次后酶活力仍能保持在67.8%以上,半衰期为8.91次。【结论】聚乙烯醇制备的固定化COD稳定性好,与底物亲和力较强,可重复回收利用,具有良好的应用前景。

类芽孢杆菌胞外胆固醇氧化酶的分离纯化

【目的】探讨类芽孢杆菌产生胞外胆固醇氧化酶(COD)的分离、纯化方法,为其生产和应用提供技术支持。【方法】将类芽孢杆菌发酵液通过旋转蒸发浓缩、蔗糖透析浓缩、DEAE离子交换柱层析和凝胶层析,纯化目的蛋白,然后测定获得酶的基本酶学性质。【结果】类芽孢杆菌发酵液经DEAE离子交换柱层析和SephadexG-75凝胶柱层析后,纯化所得的COD比活力达6.83U/mg,酶活力回收为35.6%,纯化倍数为13.4倍。纯化酶经SDS-PAGE显示为均一条带,分子量约58kDa。将纯化的COD作用于不同浓度胆固醇,采用LineweaverBurk作图法,测得其Km=3.3×10-5mol/L。薄层层析结果显示,产物为胆甾-4-烯-3-酮,说明纯化所得酶是COD。【结论】纯化获得电泳纯类的芽孢杆菌胞外COD,其与底物亲和力较强,具有潜在的应用研究价值。