羊口疮病毒ORF112基因缺失毒株的构建及增殖能力分析

利用同源重组技术构建羊口疮病毒(orf virus,ORFV)ORF112基因缺失毒株,为后续研制出高效、安全的ORFV基因工程疫苗提供候选毒株。以ORF112基因为靶基因,通过重叠PCR的方法将左、右同源臂及绿色荧光蛋白(EGFP)基因表达框,进行融合后与pUC19T载体连接,构建出pUC19T-ORFV-ΔORF112-EGFP基因转移载体。将转移载体重组质粒转染到Vero细胞与WT-ORFV基因组进行同源重组。采取有限稀释法和挑取单细胞克隆法,筛选并纯化出纯合的ORFV-ΔORF112-EGFP毒株,并对该基因缺失毒株遗传稳定性和增殖特性等进行研究。结果显示:利用有限稀释和挑取单细胞克隆方法,进行阳性重组病毒纯化,通过PCR验证和测序,成功地获得ORFV-ΔORF112-EGFP重组毒株。该重组毒株在系列传代过程中EGFP稳定表达且无减弱现象。该重组ORFV-ΔORF112-EGFP毒株与野生毒株的复制生长特性基本一致。成功构建并筛选得到纯化的ORFV-ΔORF112-EGFP基因缺失毒株,该毒株具有良好的遗传稳定性和复制能力,为后续ORFV基因工程疫苗的研制提供了候选毒株。