初步探索以“动物法则”评价鼠疫组分疫苗的临床有效性

目的依据＂动物法则＂,探索被动免疫小鼠对鼠疫强毒菌攻击的有效性,为间接评价鼠疫组分疫苗临床有效性提供依据。方法以小鼠为观察对象,依据小鼠耐受正常人血清剂量和小鼠体内异源动物血清代谢动力学研究,确定小鼠耐受正常人血清剂量和攻击时间,基于此对小鼠进行鼠疫组分疫苗免疫人血清被动免疫,观察小鼠抵抗鼠疫强毒菌攻击的存活率和存活时间,判定小鼠被动保护鼠疫强毒菌攻击的有效性。结果 BALB/c小鼠对正常人血清耐受量为1.0 m L,3~4 h间抗体滴度最高。小鼠抵抗鼠疫强毒菌攻击试验显示,在14 d的观察期内,经2MLD、6 MLD和10 MLD鼠疫强毒菌攻击的被动免疫小鼠,存活率分别为57%、25%和42%,平均存活时间依次为11.2 d、8.7 d和9.8 d;1 MLD攻击非免对照小鼠全部死亡,平均存活时间5.3 d。结论初步证实利用被动免疫小鼠可间接评价鼠疫组分疫苗临床有效性的可行性。

鼠疫疫苗Ⅱa期临床血清对小鼠的被动保护水平及其与抗体效价的相关性分析

目的根据"动物法则"验证鼠疫疫苗临床有效性免疫学指标为F1抗体效价和V抗体效价,为疫苗的临床有效性评价提供依据。方法将BALB/c小鼠随机分为6组,每组10只。其中5组用含有不同效价的F1抗体和V抗体的鼠疫疫苗IIa期临床人血清腹腔被动免疫小鼠,另外1组为对照;3 h后各实验组分别以6 MLD鼠疫耶尔森菌标准强毒菌株141株(简称鼠疫强毒菌)攻击,对照组以2MLD鼠疫强毒菌攻击,观察期14 d,详细记录14 d内的动物死亡时间,并对攻击小鼠的存活数据进行Kaplan-Meier生存分析和Spearman相关性分析。结果鼠疫疫苗IIa期临床人血清被动保护小鼠结果显示,对照组小鼠在2 MLD强毒菌攻击下的存活率为0.0%,平均存活时间为6.5 d;实验组临床人血清被动免疫小鼠在6 MLD强毒菌攻击下的存活率分别为10.0%、0.0%、40.0%、40.0%、90.0%,小鼠平均存活时间分别提高到9.1 d、9.9 d、11.2 d、11.4 d、13.9 d。F1抗体效价与小鼠平均存活时间具有显著相关性(P=0.000、r=1.000);V抗体效价与小鼠平均存活时间具有显著相关性(P=0.014、r=0.949)。F1抗体效价与小鼠存活率具有显著相关性(P=0.000、r=1.000);V抗体效价与小鼠存活率具有显著相关性(P=0.014、r=0.949)。结论鼠疫疫苗IIa期临床人血清可对小鼠提供被动保护,且保护力水平与F1抗体效价和V抗体效价具有显著相关性。

抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单克隆抗体对小鼠的被动免疫保护作用

目的研究抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单克隆抗体(单抗)被动免疫BALB/c小鼠后的抗鼠疫保护效果,确认鼠疫抗体治疗依据,探索鼠疫免疫学治疗的评价手段。方法将BALB/c小鼠随机分组,用不同剂量的抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单抗4C6和2D2分别进行免疫,再分别用不同剂量的鼠疫强毒菌攻击,通过小鼠的存活率和存活时间,判定F1单抗免疫小鼠被动保护其抵抗鼠疫强毒菌攻击的有效性和剂量相关性。结果在14 d的观察期内,在100.0 MLD鼠疫强毒菌攻击下,4C6单抗400.0μg组、200.0μg组、100.0μg组、50.0μg组和25.0μg组小鼠的存活率分别为100%、83%、50%、50%和0%,平均存活时间分别为15.00 d、14.67 d、13.00 d、13.50 d和9.67 d;2D2单抗400.0μg组、200.0μg组、100.0μg组、50.0μg组、25.0μg组小鼠的存活率分别为83%、50%、50%、33%和0%,平均存活时间分别为14.83 d、13.33 d、12.67 d、12.33 d和8.00 d。在10.0 MLD鼠疫强毒菌攻击下,4C6单抗50.0μg组、25.0μg组和12.5μg组小鼠的存活率分别为83%、83%和17%,平均存活时间分别为14.17 d、14.50 d、9.83 d;2D2单抗50.0μg组、25.0μg组、12.5μg组小鼠的存活率分别为100%、33%和33%,平均存活时间分别为15.00 d、12.33d和11.67 d。2.0 MLD和1.0 MLD攻击的未免疫对照组小鼠全部死亡,平均存活时间分别为6.1 d和6.7 d。F1抗原单抗的免疫剂量与小鼠的平均存活时间和存活率有比较明显的相关性(P<0.05)。结论用抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单抗被动免疫小鼠,在受到鼠疫强毒菌攻击时,对小鼠具有免疫保护作用。

1954—2011年青海高原鼠疫耶尔森菌CRISPR基因分型及地区分布

目的 研究青海高原鼠疫耶尔森菌（鼠疫菌）的CRISPR基因型（类群）及其地区分布.方法 选取1954—2011年间青海高原境内各县/市从人鼠疫患者、宿主动物及媒介昆虫体内分离的鼠疫菌102株,采用传统的十二烷基磺酸钠裂解和苯酚-氯仿法提取鼠疫菌DNA.分别对YPa、YPb和YPc等3个CRISPR位点进行PCR扩增、测序,然后将所测得CRISPR序列与文献最新报道的CRISPR Dictionary和NCBI数据库检索比对,以鉴定CRISPR spacer阵列.最后根据CRISPR spacer阵列的多态性对青海高原鼠疫菌进行基因分型,并描绘其地区分布特征.结果 102株鼠疫菌共发现40种spacer,包括YPa 22种、YPb 13种、YPc 5种,其中有5种新spacer,分别为a1＇、a103、a104、b4＇和b4＇;Ypa、Ypb和Ypc分别鉴定出16、10和5种不同的spacer阵列,新发现的spacer阵列为11种.102株鼠疫菌可被分为24个基因型,共归为9大CRISPR类群,分别为Cb4、Cb4＇、Cb2、Ca37、Ca7、Ca7＇、CaΔ5＇、Ca35＇和Cc3＇,其中Ca7、Ca7＇、CaΔ5＇、Ca35＇呈现出显著的聚集性特征：Ca7主要分布在玉树、囊谦、称多、杂多、治多和曲麻莱;Ca7＇分布于循化、同仁、泽库、同德、玛沁和贵南;CaΔ5＇集中在祁连、刚察、门源、大通;Ca35＇分布在湟源、海晏、刚察、天峻、德令哈、乌兰、都兰、兴海、共和和贵德.结论 青海高原鼠疫菌CRISPR种群结构复杂,Ca7、Ca7＇、CaΔ5＇和Ca35＇是流行最普遍的主要种群,这些种群呈现显著的地区分布特征,可以利用CRISPR分型技术加强该地区鼠疫检测和防控工作.

小型无人机在侦测旱獭贩运活动的应用

无人机因体型小、便携带、易操控等优点,在诸多民用领域发挥出巨大的作用。本研究利用无人机对青海高原鼠疫菌宿主——喜马拉雅旱獭的非法人为贩运活动进行侦测,以建立完善的应急处置方案和体系。通过模拟情景预设,主要构建无人机的监测平台和监控体系并予以实例检验,实践证明无人机的应用可大大节约人力、物力成本,提高侦测效率,对鼠疫的有效防控具有积极意义。

海南州鼠疫自然疫源地鼠疫菌耐消毒剂及耐药相关基因的检测

目的了解海南州鼠疫疫源地分离的鼠疫菌耐消毒剂及耐药相关基因携带状况,以指导该疫源地的鼠疫防治。方法根据美国国立生物信息中心(NCBI)公布的耐消毒剂qacEdelta1-sul1基因、耐氨基糖苷类链霉素strA、strB基因、耐β-内酰胺类抗菌药物tem、shv、ctx-m基因及耐磺胺类药物sull、sul2、sul3基因序列,分别在每个基因上设计一对引物,逐一对87株分离自青海省海南州鼠疫自然疫源地的鼠疫菌的DNA进行PCR扩增,扩增产物进行凝胶电泳,用凝胶成像系统拍照后读取结果。结果 PCR扩增结果显示,阴性对照和阳性对照均成立,87株鼠疫菌的PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳,均未在预计的DNA标志物(Mr)处出现条带,其PCR扩增结果均为阴性。1954-2016年期间从青海省海南州共和县、贵德县、同德县、兴海县、贵南县分离的鼠疫菌株中尚未发现有耐链霉素、磺胺类药、β-内酰胺类抗菌药物及耐消毒剂等相关基因的菌株。结论海南州鼠疫疫源地分离的87株鼠疫菌不具有耐消毒剂及耐药相关基因的特征。

鼠疫菌种在冻干过程中生物风险观察

目的检测鼠疫菌冻干操作过程中产生生物危险因素暴露的风险。方法采用鼠疫菌EV疫苗株进行冻干测试,采用空气采样法和无菌棉签涂抹法对其在冻干过程中可能产生生物危险因素暴露的部位进行采样,分改良前和改良后,将采样用溶血赫氏平皿和鼠疫噬菌体裂解试验平皿置28℃恒温培养箱,48 h后观察结果。结果空气采样:改良前后均无典型鼠疫菌生长,鼠疫噬菌体裂解试验阴性;无菌棉签涂抹法:改良前C过程C3阶段3个平皿有典型的鼠疫EV菌生长,鼠疫噬菌体裂解试验阳性;改良后均未培养到典型的鼠疫菌。结论鼠疫菌在冻干过程中能发生生物危险因素暴露的风险,在冻干过程中对其主要暴露环节进行干预可规避风险。