鼠疫历史疫情的考古微生物学研究进展

鼠疫是由鼠疫耶尔森氏菌(简称鼠疫菌)引发的烈性传染病,人类历史上曾发生3次大规模的鼠疫大流行。近年来,考古微生物学得到长足发展,使得研究人员可以对历史上的鼠疫疫情进行探索,为鼠疫的起源、传播以及鼠疫菌的进化等关键问题提供更为深刻的理解。本文就关于考古微生物学方法在古代鼠疫疫情研究领域取得的进展进行简单综述:包括基于PCR、蛋白质分析以及基因组序列测定在内的考古微生物学研究技术方法;基于以上技术确认查士丁尼瘟疫和黑死病的病原体为鼠疫菌;新石器时代晚期至青铜时代就已经存在人类感染鼠疫菌的病例;通过分子钟分析将鼠疫菌的物种形成时间确定为5000-7500年前。考古微生物学方法不仅可以继续推进鼠疫和鼠疫菌的相关研究,也将为其他历史传染病的研究提供有益借鉴。

初步探索以“动物法则”评价鼠疫组分疫苗的临床有效性

目的依据＂动物法则＂,探索被动免疫小鼠对鼠疫强毒菌攻击的有效性,为间接评价鼠疫组分疫苗临床有效性提供依据。方法以小鼠为观察对象,依据小鼠耐受正常人血清剂量和小鼠体内异源动物血清代谢动力学研究,确定小鼠耐受正常人血清剂量和攻击时间,基于此对小鼠进行鼠疫组分疫苗免疫人血清被动免疫,观察小鼠抵抗鼠疫强毒菌攻击的存活率和存活时间,判定小鼠被动保护鼠疫强毒菌攻击的有效性。结果 BALB/c小鼠对正常人血清耐受量为1.0 m L,3~4 h间抗体滴度最高。小鼠抵抗鼠疫强毒菌攻击试验显示,在14 d的观察期内,经2MLD、6 MLD和10 MLD鼠疫强毒菌攻击的被动免疫小鼠,存活率分别为57%、25%和42%,平均存活时间依次为11.2 d、8.7 d和9.8 d;1 MLD攻击非免对照小鼠全部死亡,平均存活时间5.3 d。结论初步证实利用被动免疫小鼠可间接评价鼠疫组分疫苗临床有效性的可行性。

鼠疫疫苗Ⅱa期临床血清对小鼠的被动保护水平及其与抗体效价的相关性分析

目的根据"动物法则"验证鼠疫疫苗临床有效性免疫学指标为F1抗体效价和V抗体效价,为疫苗的临床有效性评价提供依据。方法将BALB/c小鼠随机分为6组,每组10只。其中5组用含有不同效价的F1抗体和V抗体的鼠疫疫苗IIa期临床人血清腹腔被动免疫小鼠,另外1组为对照;3 h后各实验组分别以6 MLD鼠疫耶尔森菌标准强毒菌株141株(简称鼠疫强毒菌)攻击,对照组以2MLD鼠疫强毒菌攻击,观察期14 d,详细记录14 d内的动物死亡时间,并对攻击小鼠的存活数据进行Kaplan-Meier生存分析和Spearman相关性分析。结果鼠疫疫苗IIa期临床人血清被动保护小鼠结果显示,对照组小鼠在2 MLD强毒菌攻击下的存活率为0.0%,平均存活时间为6.5 d;实验组临床人血清被动免疫小鼠在6 MLD强毒菌攻击下的存活率分别为10.0%、0.0%、40.0%、40.0%、90.0%,小鼠平均存活时间分别提高到9.1 d、9.9 d、11.2 d、11.4 d、13.9 d。F1抗体效价与小鼠平均存活时间具有显著相关性(P=0.000、r=1.000);V抗体效价与小鼠平均存活时间具有显著相关性(P=0.014、r=0.949)。F1抗体效价与小鼠存活率具有显著相关性(P=0.000、r=1.000);V抗体效价与小鼠存活率具有显著相关性(P=0.014、r=0.949)。结论鼠疫疫苗IIa期临床人血清可对小鼠提供被动保护,且保护力水平与F1抗体效价和V抗体效价具有显著相关性。

抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单克隆抗体对小鼠的被动免疫保护作用

目的研究抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单克隆抗体(单抗)被动免疫BALB/c小鼠后的抗鼠疫保护效果,确认鼠疫抗体治疗依据,探索鼠疫免疫学治疗的评价手段。方法将BALB/c小鼠随机分组,用不同剂量的抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单抗4C6和2D2分别进行免疫,再分别用不同剂量的鼠疫强毒菌攻击,通过小鼠的存活率和存活时间,判定F1单抗免疫小鼠被动保护其抵抗鼠疫强毒菌攻击的有效性和剂量相关性。结果在14 d的观察期内,在100.0 MLD鼠疫强毒菌攻击下,4C6单抗400.0μg组、200.0μg组、100.0μg组、50.0μg组和25.0μg组小鼠的存活率分别为100%、83%、50%、50%和0%,平均存活时间分别为15.00 d、14.67 d、13.00 d、13.50 d和9.67 d;2D2单抗400.0μg组、200.0μg组、100.0μg组、50.0μg组、25.0μg组小鼠的存活率分别为83%、50%、50%、33%和0%,平均存活时间分别为14.83 d、13.33 d、12.67 d、12.33 d和8.00 d。在10.0 MLD鼠疫强毒菌攻击下,4C6单抗50.0μg组、25.0μg组和12.5μg组小鼠的存活率分别为83%、83%和17%,平均存活时间分别为14.17 d、14.50 d、9.83 d;2D2单抗50.0μg组、25.0μg组、12.5μg组小鼠的存活率分别为100%、33%和33%,平均存活时间分别为15.00 d、12.33d和11.67 d。2.0 MLD和1.0 MLD攻击的未免疫对照组小鼠全部死亡,平均存活时间分别为6.1 d和6.7 d。F1抗原单抗的免疫剂量与小鼠的平均存活时间和存活率有比较明显的相关性(P<0.05)。结论用抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单抗被动免疫小鼠,在受到鼠疫强毒菌攻击时,对小鼠具有免疫保护作用。

青海省近年来鼠疫防控形势分析

目的分析青海省近年来鼠疫监测结果,掌握现阶段青海省鼠疫流行态势,为今后鼠疫防控工作提供科学依据。方法收集青海省近年来的鼠疫监测、鼠疫疫源地调查及人间鼠疫病例数据,应用描述性流行病学方法进行分析。结果近年来,青海省共发生人间鼠疫一起,动物间鼠疫疫情时有发生,主要宿主(旱獭)分布密度明显升高,平均密度达0.09只/hm2;检出鼠疫FI阳性血清45份,鼠疫反向血凝实验阳性材料9份;分离鼠疫菌11株,主要分布在海西州和玉树州。结论近年来,青海省动物鼠疫每年均有发生,局部地区仍处于活跃状态,且部分区域有向人口密集区扩散的趋势,鼠疫防治总体形势较为严峻。

青海省藏系绵羊引起人间鼠疫的流行病学特征分析

目的分析青海省藏系绵羊引起的人间鼠疫流行及其危险因素。方法青海省1956—2014年藏系绵羊引起的人间鼠疫背景资料来源于青海省鼠疫监测报告和鼠疫防治信息资料库。对数据进行分析．描述地区、时间分布等。结果1956—1997年，青海省藏系绵羊引起人间鼠疫16起，发病69人，死亡42人，病死率为60．9％；1998—2014年，未发生藏系绵羊引起的人间鼠疫。首发病例均为牧民，因剥、食、接触病死于鼠疫的藏系绵羊而发病。玉树州藏系绵羊引起的人间鼠疫10起，占62．5％（10／16），其次为果洛州3起，占18．8％（10／16）；海西州和海北州分别为2、l起，各占12．5％（2／16）和6．2％（1／16）；发病时间为5—11月。结论藏系绵羊感染鼠疫可波及人类，应加强鼠防知识宣传，降低人类感染鼠疫的风险。

青海省玉树市藏系绵羊鼠疫病原学分析及流行病学意义

目的探讨青海省玉树市藏系绵羊鼠疫菌生物学特性及流行病学意义，为鼠疫防治提供科学依据。方法选择1975—2005年从玉树市境内藏系绵羊体内分离的10株鼠疫菌为研究对象，进行生化试验、毒力因子鉴定、毒力测定、质粒分析、差异片段（DFR）分型研究。结果10株鼠疫菌的生物型均为古典型；9株菌生态型为青藏高原型，1株为祁连山型；基因型均为5型。10株菌的质粒谱相同，相对分子质量都为6×10^6、45×10^6、65×10^6。50．00％（5／10）的鼠疫菌具备4个毒力因子，毒力检测结果显示，均为强毒菌。结论玉树市藏系绵羊分离的菌株均具备青藏高原鼠疫病原体特性。藏系绵羊鼠疫对人民群众身体健康和经济发展仍然存在潜在威胁。应加强对其的监测及相关健康教育工作的普及力度。

青海省喜马拉雅旱獭对栖息地植被条件选择的初步研究

目的 利用地理信息技术定量分析青海省喜马拉雅旱獭栖息地与植被覆盖度、草地类型、植被类型等植被要素的关系。方法 利用ArcGIS软件将青海省地方病预防与控制研究所提供的青海省喜马拉雅旱獭实地调查数据与植被覆盖度、草地类型等遥感和地理信息数据进行空间叠加，提取喜马拉眼旱獭发现样点所在位置的植被特征信息，并进行统计分析，进而就喜马拉雅旱獭对栖息地植被条件的选择进行初步的定量分析。结果 经筛选后保留84个有喜马拉雅旱獭活动的野外样点，其植被覆盖度均值为0.708 5，范围为0.313 3 ~ 1.000 0；54.76%（46／84）的旱獭发现样点集中在植被覆盖度为0.70 ~ 1.00的地区。9个草地类型中，高寒草甸占青海省总面积的39.78%，分布着59个旱獭发现样点，占样点总数的70.24%（59／84）。喜马拉雅旱獭主要以草地植物部分种类的根茎为食，包括早熟禾、高山嵩草、委陵菜、珠芽蓼、藏嵩草、棘豆、紫菀以及各种杂类草。结论 植被条件是喜马拉雅旱獭栖息地选择的重要因素之一，利用地理信息技术进行喜马拉雅旱獭空间分布与植被要素相互间定量分析，可以加深对旱獭栖息地选择认识，并为草原鼠疫监控和防治提供依据。

青海省祁连县鼠疫菌病原学分析及流行病学意义

目的 探讨青海省祁连县鼠疫菌株生物学特点及流行病学意义，为该地区的鼠疫防治提供科学依据。方法 对1958 - 2011年青海省祁连县分离的67株鼠疫菌进行生化试验、毒力测定、毒力因子鉴定、质粒分析、鼠疫菌差异区段（different region，DFR）分型等研究。结果 根据生化指标，67株被试菌株中48株为青藏高原型，15株为祁连山型，其余4株与青海省疫源地生态型菌株均不相同；DFR分为8个基因组型，分别为8型（42株）、44型（15株）、5型（4株）、7型（2株）、19型（1株）、30型（1株）、32型（1株）、34型（1株）；95.52%（64／67）的被试菌株携带相对分子质量为6×10^6、45×10^6、52×10^6的质粒；85.07%（57／67）的鼠疫菌4个毒力因子俱全；96.00%（48／50）的鼠疫菌为强毒菌。结论 青海省祁连县分离的鼠疫菌具备青藏高原鼠疫病原体特性，鼠疫菌的毒力强，因此，要加大鼠疫监测力度和鼠疫防治知识宣传力度，严防动物间鼠疫波及人间。

青海省果洛藏族自治州鼠疫耶尔森菌病原学分析及耐药相关基因检测

目的对青海省果洛藏族自治州(果洛州)鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)进行病原学分析及耐药相关基因检测,为该地区的鼠疫防治提供科学依据。方法对1978-2016年间青海省果洛州分离的13株鼠疫菌进行糖醇类酵解试验、毒力测定、毒力因子检测、质粒分析及鼠疫菌基因差异区段(DFR)分型等研究,并根据美国国立生物信息中心(NCBI)公布的耐氨基糖苷类链霉素strA、strB基因、耐β-内酰胺类抗菌药物tem、ctx-m基因和耐磺胺类药物sul1、sul2基因序列,在每个基因上设计1对引物,以该13株鼠疫菌DNA为模板分别进行上述6个耐药基因的PCR扩增,以检测其是否携带耐药相关基因。结果根据生化分型指标,13株被试菌株中9株为青藏高原型,4株为祁连山型。毒力测定结果显示,13株被试菌株均为强毒级别的鼠疫菌,13株菌中有11株具备鼠疫菌特有的4个毒力因子,被试菌株携带相对分子质量分别为6×106、45×106、65×106和6×106、45×106、52×106的2种质粒谱。DFR分为4个基因组型,5型(7株)、8型(4株)、36型和01b型(各1株)。耐药基因检测结果显示,阴性对照和阳性对照均成立的情况下,所测13株鼠疫菌的PCR检测结果均为阴性,未发现耐链霉素、耐β-内酰胺类抗菌药物及耐磺胺类药物的菌株。结论青海省果洛州分离的鼠疫菌具备青藏高原鼠疫病原体特征,鼠疫菌的毒力强,但尚未出现耐抗菌药物菌株,但仍需加强鼠疫监测和鼠疫防治知识宣传力度,严防动物间鼠疫波及人间。

1980-2015年青海省海北州鼠疫流行病学分析

目的探讨青海省海北州1980-2015年鼠疫流行动态,为制定预防控制对策提供依据。方法应用Excel软件分析1980-2015年青海省地方病预防控制所人间鼠疫病例数据库、鼠疫监测和鼠疫疫源地调查资料。结果 1980-2015年海北州从各种染疫动物体内分离鼠疫菌50株,动物鼠疫流行的地区除刚察县外,祁连县、门源县、海晏县均有分布。期间除1982、1987、2003、2004年发生人间鼠疫外,其余年份均未发生人间鼠疫,共发生人间鼠疫4起,死亡3例,其中祁连县3例、门源县1例,发病时间为7~9月。结论青海省海北州鼠疫流行猛烈,人间鼠疫在该州有明显抬头的趋势。应加强对动物间鼠疫的监测,落实各项综合防控措施。

青海省海南州藏系绵羊鼠疫血清流行病学调查

目的了解海南州藏系绵羊鼠疫流行情况,为鼠疫的预防预警提供理论依据。方法采集藏系绵羊(以下简称为藏羊)血清,应用鼠疫间接血凝(Indirect hemagglutination test,IHA)和鼠疫胶体金(gold immunochromatography assay,GICA)两种方法分别检测藏羊血清鼠疫FI抗体。结果对2016年采集自海南州的1 734份藏羊血清进行检测,共检出阳性血清28份,两种方法的相符率为100.00%,其中鼠疫F1抗体滴度1∶20的16份、1∶40的9份、1∶80的3份。结论海南州存在藏羊鼠疫流行,特别是在海南州兴海县,应加强藏羊鼠疫的监测。

青海省果洛藏族自治州藏系绵羊血清鼠疫F1抗体流行病学调查

目的对青海省果洛藏族自治州藏系绵羊进行血清鼠疫F1抗体检测，了解当地藏系绵羊鼠疫流行情况。方法2014、2015年在果洛藏族自治州的玛沁县、玛多县、甘德县、班玛县、久治县、达日县。采集藏系绵羊颈静脉全血分离血清，应用鼠疫间接血凝试验（IHA）、胶体金纸上色谱（GICA）法进行鼠疫F1抗体血清学检测。结果共采集藏系绵羊血清1481份，其中玛沁县566份、玛多县315份、甘德县150份、班玛县150份、久治县150份、达日县150份。检出鼠疫F1抗体阳性血清14份，阳性率为0.95％（14／1481），全部来源于玛沁县。结论果洛藏族自治州存在藏系绵羊鼠疫的流行，应加强藏系绵羊鼠疫的防治监测工作。

2011—2015年青海省鼠疫流行病学分析

青海省位于青藏高原东北部，面积约72．12万平方公里。1954年，青海省首次判定了鼠疫疫源地，目前已判定的鼠疫疫源县有30个（另有4个县监测到鼠疫F1阳性血清），鼠疫疫源地面积约40km^2。近年来，新的疫源地、宿主及媒介昆虫不断被发现，动物间鼠疫疫情连年不断。

青海省海南州1970-2015年鼠疫流行病学分析

目的探讨海南州1970-2015年鼠疫流行动态,为制定该地区预防控制对策提供依据。方法应用Excel软件分析1970-2015年青海省地方病预防控制所人间鼠疫病例数据库、鼠疫监测和鼠疫疫源地调查资料。结果 1970-2015年海南州从各种染疫动物及媒介体内分离鼠疫菌38株,以喜马拉雅旱獭为主,占47.4%(18/38),动物鼠疫流行地区为共和、贵德、贵南、同德、兴海5县,动物鼠疫的流行季节为每年的5~11月,高峰期为6~9月。累计发生人间鼠疫疫情9起,发病69例,死亡8例。结论海南州鼠疫流行猛烈,人间鼠疫疫情呈上升趋势,鼠疫疫源性相对稳固。应加强鼠疫监测和预警,落实各项综合防控措施,以减少鼠疫的发生和流行。

青海省称多县鼠疫菌生化与分子生物学特征分析

目的探讨青海省称多县鼠疫菌株生物学特点及流行病学意义，为该地区的鼠疫防治提供科学依据。方法以1980—2011年称多县分离的31株鼠疫菌株作为实验对象，进行生化试验、毒力因子鉴定[荚膜抗原（F1）、色素沉着因子（Pgm）、鼠疫杆菌素I（Pst I）、毒力抗原因子（VW）]、差异片段（DFR）分型，并根据不同时间、不同地区、不同宿主选取19株菌株进行小白鼠毒力测定，以最小致死量（MLD）表示，MLD≤10000为强毒菌，10000〈MLD〈100000为中等毒力菌。结果31株被试菌株中，有23株是从喜马拉雅旱獭及其媒介蚤、虱和人体分离的，生物型为古典型，生化型为青藏高原型；21株基因型为5型，1株为16型，1株为32型；F1、Pgm、Pst I、VW4种毒力因子俱全，毒力测定结果为强毒菌（14株）。有8株是从青海田鼠及其媒介蚤分离的，生物型为田鼠型，生化型为川1青高原型；均能产生F1及Pgm，其中87．5％（7／8）的菌株可以产生Pst I，均不能产生VW抗原因子；基因型为14型，毒力测定结果为强毒菌（3株）、中等毒力菌（2株）。结论青海省称多县1980—2011年鼠疫菌株具备青藏高原鼠疫病原体特性，鼠疫菌毒力强，鼠疫防治工作不容松懈。

1954—2011年青海高原鼠疫耶尔森菌CRISPR基因分型及地区分布

目的 研究青海高原鼠疫耶尔森菌（鼠疫菌）的CRISPR基因型（类群）及其地区分布.方法 选取1954—2011年间青海高原境内各县/市从人鼠疫患者、宿主动物及媒介昆虫体内分离的鼠疫菌102株,采用传统的十二烷基磺酸钠裂解和苯酚-氯仿法提取鼠疫菌DNA.分别对YPa、YPb和YPc等3个CRISPR位点进行PCR扩增、测序,然后将所测得CRISPR序列与文献最新报道的CRISPR Dictionary和NCBI数据库检索比对,以鉴定CRISPR spacer阵列.最后根据CRISPR spacer阵列的多态性对青海高原鼠疫菌进行基因分型,并描绘其地区分布特征.结果 102株鼠疫菌共发现40种spacer,包括YPa 22种、YPb 13种、YPc 5种,其中有5种新spacer,分别为a1＇、a103、a104、b4＇和b4＇;Ypa、Ypb和Ypc分别鉴定出16、10和5种不同的spacer阵列,新发现的spacer阵列为11种.102株鼠疫菌可被分为24个基因型,共归为9大CRISPR类群,分别为Cb4、Cb4＇、Cb2、Ca37、Ca7、Ca7＇、CaΔ5＇、Ca35＇和Cc3＇,其中Ca7、Ca7＇、CaΔ5＇、Ca35＇呈现出显著的聚集性特征：Ca7主要分布在玉树、囊谦、称多、杂多、治多和曲麻莱;Ca7＇分布于循化、同仁、泽库、同德、玛沁和贵南;CaΔ5＇集中在祁连、刚察、门源、大通;Ca35＇分布在湟源、海晏、刚察、天峻、德令哈、乌兰、都兰、兴海、共和和贵德.结论 青海高原鼠疫菌CRISPR种群结构复杂,Ca7、Ca7＇、CaΔ5＇和Ca35＇是流行最普遍的主要种群,这些种群呈现显著的地区分布特征,可以利用CRISPR分型技术加强该地区鼠疫检测和防控工作.

Biolog微生物鉴定系统对鼠疫菌弱毒株及其噬菌体耐受株的鉴定比较研究

目的应用Biolog微生物鉴定系统鉴定比较鼠疫菌弱毒株(614F株)及其耐受菌株(R-2-12、R-2-51和R-2-56)生化、营养等表型特征。方法参照Biolog微生物鉴定系统标准规程A,使用Retro Spect’ s分析软件进行分析。结果利用Biolog微生物鉴定系统Gen III鉴定板检测显示,鼠疫菌614F株及其耐受菌株(R-2-56)不能发酵麦芽糖、密二糖、鼠李糖;614F株L-脯氨酸反应阳性,而614F株耐受中间代R-2-12、R-2-51株和耐受株R-2-56 L-脯氨酸反应阴性;614F株氨曲南反应阴性,而614F株耐受中间代R-2-12、R-2-51株和耐受株R-2-56氨曲南反应阳性。结论 614F株与其耐受菌株(R-2-12、R-2-51、R-2-56)比较生化表型无改变,但营养特征(脯氨酸)反应和抗生素(氨曲南)反应有差别。提示鼠疫菌弱毒菌614F株耐受株在耐受过程中营养需求和抗生素的抗性发生改变。

小型无人机在侦测旱獭贩运活动的应用

无人机因体型小、便携带、易操控等优点,在诸多民用领域发挥出巨大的作用。本研究利用无人机对青海高原鼠疫菌宿主——喜马拉雅旱獭的非法人为贩运活动进行侦测,以建立完善的应急处置方案和体系。通过模拟情景预设,主要构建无人机的监测平台和监控体系并予以实例检验,实践证明无人机的应用可大大节约人力、物力成本,提高侦测效率,对鼠疫的有效防控具有积极意义。

中国鼠疫耶尔森菌表型及其基因分型研究

目的了解中国不同鼠疫自然疫源地鼠疫耶尔森菌(简称鼠疫菌)表型及其基因型分布,为鼠疫防控提供科学依据。方法选取涵盖1943年以来中国11个鼠疫自然疫源地不同时间、地区、宿主、媒介体内分离的2184株鼠疫菌,对其进行生化型鉴定,糖醇类酵解试验,毒力因子[荚膜抗原(F1)、鼠疫菌素Ⅰ(PstⅠ)、毒力抗原因子(VWa)、色素沉着因子(Pgm)]试验,差异区段(DFR)分型和规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)分型研究。结果中国鼠疫自然疫源地鼠疫菌分为16个生化型,各疫源地间呈明显的地区性分布。大多数菌株对阿胶糖(89.79%,1961/2184)、麦芽糖(80.13%,1750/2184)、甘油(94.23%,2058/2184)酵解阳性,脱氮反应(82.78%,1808/2184)阳性,对鼠李糖(88.78%,1939/2184)、密二糖(85.62%,1870/2184)酵解阴性。毒力因子试验结果显示,99.95%(2183/2184)的鼠疫菌F1阳性;99.73%(2178/2184)的鼠疫菌能产生PstⅠ;73.31%(1601/2184)的鼠疫菌VWa阳性,26.69%(583/2184)的鼠疫菌VWa阴性;Pgm阳性菌株占72.62%(1586/2184),Pgm阴性菌株占21.52%(470/2184),Pgm混合型菌株占5.86%(128/2184)。DFR分型结果显示,2184株鼠疫菌共包括52个基因型,其中19个为主要基因型,33个为次要基因型。CRISPR分型发现16个主要基因型,其中7个为新发现基因型。结论中国各鼠疫自然疫源地鼠疫菌表型和基因型多样且具有地区分布特性。