基于GBS简化基因组测序评估3个麦洼牦牛保种群的遗传结构研究

麦洼牦牛是青藏高原地区优良的乳肉兼用型牦牛品种,本研究旨在探究四川省龙日种畜场麦洼牦牛保种群的遗传多样性和遗传结构,评价3个不同保种群的保种效果并挖掘重要种质特性基因。对麦洼牦牛3个保种群粉嘴群(n=140)、全黑群(n=211)、弗洛群(n=55)进行GBS简化基因组测序,基于检测到的126122个单核苷酸多态性(SNPs)标记计算遗传统计量,结果表明,整个牦牛群的平均观测杂合度(Ho)和平均期望杂合度(He)为0.3038和0.3036,麦洼牦牛的遗传多样性较丰富。全黑群、粉嘴群、弗洛群的观测杂合度Ho分别为0.3029、0.3042、0.3044,近交系数Fis分别为0.0144、0.0152、0.0209,弗洛群和粉嘴群受人工选择的强度大于全黑群,较低的近交水平说明3个群的保种效果较好。Structure分析中全黑、弗洛群部分个体血缘较纯正,而其他个体血缘关系非常混杂;粉嘴群和全黑群的遗传分化系数(Fst)和遗传距离(DR)最大为0.03513、0.0358,结合系统进化树表明两者亲缘关系最远,有遗传分化趋势。利用Fst和π法对3个保种群进行选择信号分析,发现有104个受选择基因广泛参与生殖机能、免疫系统、胚胎发育、脂质代谢等条目以及生殖激素、内/外分泌、信号传递等通路,其中部分基因提示麦洼牦牛的繁殖、肉质、毛色性状以及应激反应得到了人工选择,如PPP3CC、KCNMA1、ROCK2、GNAQ、MEF2C、KIT等。现有的麦洼牦牛保种策略是可行的,研究结果为未来麦洼牦牛的保种选育和遗传改良提供了参考依据。

犏牛和牦牛ESCO2基因的序列特征及其在睾丸中的表达对比分析

旨在克隆犏牛和牦牛姐妹染色单体内聚建立蛋白2(establishment of sister chromatid cohesion N-acetyltransferase 2,ESCO2)基因,并分析其在不同发育阶段睾丸中的表达与定位,为进一步解析ESCO2在减数分裂过程中的作用机制提供理论依据。本研究以健康雄性犏牛及牦牛为试验动物,根据年龄分为胎牛组(5~6月龄)、幼年组(1~2岁)和成年组(3~4岁),每组各3头。通过RT-PCR技术克隆犏牛和牦牛ESCO2基因并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测ESCO2基因在犏牛不同组织中的表达谱,比较分析ESCO2在犏牛和牦牛不同时期睾丸中的表达规律,利用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)技术检测ESCO2蛋白的细胞定位和表达差异。结果显示,犏牛ESCO2基因(GenBank登录号:MW198470)CDS区为1833 bp,编码610个氨基酸,与牦牛相比,犏牛ESCO2序列第301~319位多19个氨基酸,另有3个氨基酸突变;犏牛ESCO2蛋白序列与黄牛的同源性高于其他哺乳动物;ESCO2可能与SMC3、SMC1A、PDS5A、PDS5B、STAG2等蛋白相互作用,互作蛋白功能与姐妹染色单体凝聚、减数分裂细胞周期、DNA修复、细胞分裂和染色体重构等生物学过程相关。ESCO2在犏牛各组织中均有表达,但在睾丸中的相对表达水平显著高于其它组织(P<0.05);在犏牛睾丸中的表达随年龄增长呈上升趋势,幼年和成年时期犏牛睾丸中ESCO2的表达显著低于同时期牦牛(P<0.05);IHC染色结果发现,雄性犏牛减数分裂阻滞于初级精母细胞,ESCO2蛋白在犏牛初级精母细胞中无表达并与牦牛存在差异。本研究结果表明,犏牛与牦牛的ESCO2基因、蛋白序列差异较大,且在睾丸发育过程中的表达模式差异显著,这可能是引起雄性犏牛减数分裂阻滞及不育的原因之一,其具体作用机制有待进一步研究。

KASP技术及其在牛SNP分型中的应用研究进展

竞争性等位基因特异性聚合酶链式反应(kompetitive allele specific PCR,简称KASP)是一种基于单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,简称SNP)的新型基因分型技术,可从基因组水平对SNP和插入缺失多态性(insertion and deletion,简称Indel)进行精准分型,被广泛应用于生命科学研究以及医学领域。KASP与其他分型技术相比,支持低、中、高通量SNP检测,具备成本低、特异性好、准确性高等优势,可通过分子检测手段对家畜功能基因进行准确分型,从而达到优良性状的定向改良育种目标。目前,KASP技术已在牛功能基因相关SNP检测、疾病分型等方面应用起来,本文对近年来KASP技术及其在牛SNP基因分型中的应用研究进展进行概述,以期为该技术在牛的产乳、产肉等性状的改良应用方面提供借鉴。

犏牛PPP1R11基因的克隆及在睾丸中的表达规律研究

旨在克隆犏牛蛋白磷酸酶1调节亚基11(protein phosphatase 1 regulatory subunit 11,PPP1R11)基因,分析其在不同发育阶段睾丸中的表达与定位,为解析其在雄性生殖中的功能机制提供理论依据。本研究采集成年犏牛睾丸、附睾、心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、胃、肌肉和脂肪组织(n=3),犏牛和牦牛在胎牛时期(5~6月龄)、幼年时期(1~2岁)和成年时期(3~4岁)睾丸(n=3)作为试验材料。通过RT-PCR技术克隆犏牛PPP1R11基因并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)构建PPP1R11基因在犏牛不同组织中的表达谱,比较分析PPP1R11在犏牛和牦牛不同时期睾丸中的表达,利用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)技术检测PPP1R11蛋白的细胞定位和表达。结果显示,犏牛PPP1R11基因CDS区为324 bp,编码107个氨基酸,犏牛PPP1R11蛋白与其他哺乳动物同源性较高;PPP1R11可与PPP1R2、PPP1R7、PPP1CB和UTP20等蛋白相互作用,互作蛋白功能主要与蛋白质的磷酸化相关,参与调控睾丸发育、精子发生和性成熟等生物学过程。PPP1R11在犏牛组织中广泛表达,其中在睾丸组织中的表达量最高,相对表达水平极显著高于其它组织(P<0.01);该基因在犏牛睾丸中的表达量随年龄增长呈上升趋势,幼年和成年时期犏牛睾丸中PPP1R11的表达与同时期牦牛相比差异极显著(P<0.01);IHC染色结果发现,PPP1R11蛋白在犏牛精原细胞和支持细胞中低表达并与牦牛存在显著差异,雄性犏牛初级精母细胞数量减少并且减数分裂阻滞于此。本研究表明,犏牛与牦牛PPP1R11在睾丸中存在时空表达差异,提示该基因可能与犏牛雄性不育相关,其具体作用机制有待进一步研究。

牦牛KIF2A基因克隆及其在卵泡与卵母细胞发育过程的表达规律

旨在克隆牦牛驱动蛋白家族成员2A基因(KIF2A),探究其在牦牛不同组织中的表达模式,以及在卵泡发育和卵母细胞成熟过程中的表达规律,以3~4岁健康、未妊娠母牦牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、子宫和卵巢组织(n=5)为研究材料,使用RT-PCR技术获得KIF2A基因的编码区序列(CDS),运用MEGA 7.0、SWISS-MODEL等软件分析其生物学特性。使用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RT-qPCR)检测KIF2A在牦牛各组织中的表达水平;采用免疫组织化学技术分析KIF2A在牦牛不同直径卵泡中的表达模式及定位。将卵泡按照直径的大小分为3组:小(1.0~2.9 mm)、中(3.0~5.9 mm)、大(6.0~9.0 mm)卵泡;RT-qPCR检测KIF2A基因在不同发育时期卵泡中颗粒细胞、卵母细胞减数分裂3个关键时期的表达特性。结果显示,KIF2A基因序列长为1964 bp,其中CDS为1530 bp,编码509个氨基酸,KIF2A蛋白总体带负电,属于疏水性蛋白。KIF2A基因在牦牛各组织中广泛表达,牦牛KIF2A蛋白主要定位于颗粒细胞,且伴随着卵泡的生长发育其在不同直径大小卵泡颗粒细胞中mRNA表达量呈上升趋势。在牦牛卵母细胞成熟过程中,KIF2A基因的表达具有时序特征,其mRNA的表达量呈下降趋势,GⅤ期显著高于MⅠ期和MⅡ期。综上所述,KIF2A可能参与调控牦牛卵泡发育和卵母细胞的成熟过程。

雄性犏牛不育机制的研究进展

犏牛是牦牛与普通牛的杂交后代,是高原牧区的主要家畜之一,占有重要的经济地位。雄性犏牛不育阻碍了对犏牛杂种优势的利用,严重制约了我国高原畜牧业发展,因此对犏牛雄性不育机制的研究具有重要意义。本文从组织学、生理学、基因表达调控、转录组、蛋白质组和表观遗传学等方面概述了雄性犏牛不育的机制,以期为进一步探索犏牛雄性不育机制提供研究思路且为未来修复雄性犏牛生殖力奠定基础。

牦牛GnIH基因生物学特征分析及其在卵巢颗粒细胞中亚细胞定位的研究

为探究促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone, GnIH)基因的序列特征及其在牦牛卵巢颗粒细胞中的表达与定位,试验从牦牛卵巢组织cDNA中克隆了GnIH基因,利用在线软件进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测GnIH基因在牦牛各器官中的表达情况,通过免疫组织化学和免疫荧光法检测GnIH在组织中的表达及定位。结果表明:GnIH基因编码序列(CDS)区大小为591 bp,编码196个氨基酸;牦牛GnIH基因与黄牛和野牦牛同源性最高;GnIH前体为不稳定亲水酸性蛋白,且无跨膜结构,在第26,27个氨基酸间有信号肽区域,同时GnIH前体包含了3个磷酸化位点,二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成。GnIH基因在卵巢中的相对表达量显著高于其他组织(P<0.05);随着卵泡的增长发育,GnIH基因在卵泡颗粒细胞中的表达量呈上升趋势,大卵泡(≥6 mm)中GnIH基因相对表达量最高,显著高于中(>3~<6 mm)、小卵泡(≤3 mm)(P<0.05),而中、小卵泡之间差异不显著(P>0.05)。GnIH在卵巢颗粒细胞的细胞核及细胞质中均有表达。说明牦牛GnIH基因参与了牦牛的卵泡发育调控。