小鼠睾丸荧光定量PCR分析的内参基因筛选

旨在筛选出小鼠睾丸组织中最优内参基因,为研究小鼠睾丸发育过程中的目的基因表达提供基础依据.以小鼠作为研究对象,采用Trizol法提取4个不同发育时期(1周龄、3周龄、6周龄、9周龄)睾丸组织总RNA并反转录获得其cDNA.且根据已有报道,选出小鼠常见相对稳定的7种内参基因β-肌动蛋白(β-actin)、肽基异构酶A(PPIA)、酸性核糖体磷酸蛋白(ARBP)、18S核糖体RNA(18S rRNA)、琥珀酸脱氢酶复合黄蛋白亚基A(SDHA)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(HPRT1)的GenBank登陆序列设计所需荧光定量引物,结合实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术分别验证候选基因引物特异性并构建以睾丸组织为模板各基因的标准曲线,并通过GeNorm程序对各基因稳定性进行分析,筛选出小鼠睾丸中最适内参基因.结果表明,各个时期睾丸组织RNA电泳条带没有出现弥散和拖带的现象;所设计的候选基因引物条带单一没有杂带且RT-qPCR溶解曲线均呈现单一信号峰,并具有良好的线性关系;候选基因稳定性值(M值)进行排序:PPIA=β-actin>ARBP>HPRT1>SDHA>18S rRNA>GAPDH,获得小鼠睾丸中稳定性最好的2个内参基因(PPIA和β-actin).综上表明,本研究成功筛选出小鼠睾丸发育过程中稳定表达的内参基因.

牦牛KDM7A表达谱分析及其在卵母细胞减数分裂进程中的表达

为探究组蛋白去甲基化酶7A(KDM7A)在牦牛生殖发育过程中的作用机制及表达模式,以牦牛作为研究对象,通过RT-PCR技术克隆获得牦牛KDM7A编码区序列,结合相关生物信息学分析软件分析KDM7A蛋白的结构和功能,利用实时荧光定量PCR(RT-PCR)获得KDM7A mRNA在牦牛卵巢、肾、胃、小肠、肌肉、心、子宫、脾、肺和肝中的表达水平,并分析该基因在卵母细胞成熟过程中的表达规律。结果显示,克隆出牦牛2704 bp的KDM7A基因,其中CDS区全长为2409 bp,共编码802个氨基酸。牦牛与其他物种中黄牛、野牛及山羊同源性较高;KDM7A在牦牛各组织中广谱表达,其在子宫中的相对表达量最高,显著高于除胃以外其他组织(P<0.05),而在肾脏和肌肉组织中相对表达量较低,显著低于其他组织(P<0.05);在卵母细胞减数分裂过程中,KDM7A基因具有时空动态表达特征,减数第二次分裂中期相对表达量显著高于减数第一次分裂中期和卵母细胞生发泡期(P<0.05)。综上表明,KDM7A在遗传进化过程中高度保守,在牦牛卵母细胞减数分裂进程中具有时序性表达模式,提示KDM7A参与卵母细胞的减数分裂进程,为深入探究牦牛KDM7A在生殖过程中的作用机制提供基础依据。

牦牛KAT8基因在组织及卵泡发育过程中的表达

探究组蛋白乙酰化酶8(KAT8)在牦牛卵泡发育及卵母细胞成熟过程中的表达规律,为深入探讨KAT8在雌性牦牛生殖过程中的作用机制提供参考。采集3~5周岁成年未妊娠母牦牛卵巢,分离培养出生发泡时期(GV)、第1次减数分裂中期(MⅠ)和第2次分裂中期(MⅡ)的卵母细胞,分别提取上述3个时期卵母细胞总RNA,反转录获得cDNA。以卵巢cDNA为模板,采用分段扩增方法,利用RT-PCR技术克隆牦牛KAT8基因编码区(CDS)序列,运用相关生物信息学分析软件预测KAT8编码蛋白的结构功能。利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测KAT8 mRNA在牦牛卵巢、肾脏、胃、小肠、肌肉、心脏、子宫、脾脏、肺脏和肝脏组织及GV、MⅠ、MⅡ期卵母细胞中的相对表达量,采用免疫组织化学技术分析KAT8在牦牛卵泡发育不同时期的表达定位。结果显示,克隆出牦牛1938 bp KAT8基因,其中CDS区全长为1377 bp,共编码458个氨基酸。物种进化树结果表明,牦牛与黄牛、野牛、绵羊及山羊的核苷酸序列同源性较高,分别为99.64%,99.27%,98.33%,98.04%。KAT8在牦牛各组织中广谱表达,肌肉、心脏和卵巢中的表达量相对较高,极显著高于其他7个组织(P<0.01),其中肌肉和心脏中的相对表达量显著高于卵巢组织(P<0.05)。免疫组织化学检测发现,KAT8在各发育阶段的牦牛卵泡中均有表达,主要定位于卵母细胞及颗粒细胞,卵泡膜细胞中表达相对较少。在卵母细胞减数分裂过程中,KAT8表达水平呈下降趋势,GV期卵母细胞KAT8 mRNA表达量相对较高,但与MⅠ和MⅡ期均无显著性差异(P>0.05)。KAT8基因在遗传进化过程中高度保守,并在牦牛卵泡发育及卵母细胞减数分裂进程中呈现动态表达模式,提示KAT8参与卵泡发育及卵母细胞减数分裂成熟过程。