小干扰RNA在心肌细胞中对柯萨奇病毒B3复制的抑制作用研究

目的通过在原代心肌细胞培养上研究小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）介导的基因干扰对病毒增殖的抑制和细胞内免疫清除作用，评价siRNA在治疗病毒性感染中的可能性。方法体外制备BALB／c乳鼠心肌细胞，利用脂质体和电穿孔转染方法转染siRNA后感染病毒，流式细胞术、中性红染色和病毒致细胞病变作用（CPE）保护实验评价转染效率和细胞生长状态，空斑形成减少实验、RT-PCR等方法检测抑制病毒程度。结果通过在HeLa细胞上的筛选，针对病毒不同区域的siRNA呈现出不同的抗病毒作用，靶序列位于2B区的siRNA-3753能显著抑制柯萨奇病毒B3（CVB3）感染。在原代培养的心肌细胞中，转染siRNA-3753后同样显示出很好的抗病毒效果，心肌的搏动、心肌细胞的生长状况保持着较好的状态。而病毒对照和非特异性siRNA-non感染24h后，细胞停止搏动，逐步变圆，皱缩死亡。测定培养上清和细胞内的病毒滴度，电转siRNA-3753对病毒抑制率可以达到98．1％，脂质体转染siRNA-3753对病毒抑制率为78.2％。电穿孔转染效率可以达到56.03％，脂质体为9.0％。结论针对CVB3基因组2B区的siRNA在保护心肌细胞抵抗CVB3病毒感染实验中具有抑制病毒复制作用。

儿童特发性血小板减少性紫癜淋巴细胞亚群和血小板相关抗体的检测意义

儿童特发性血小板减少性紫癜（ITP）是一种临床常见的儿童出血性疾病,其发生和发展与免疫功能紊乱相关。我们于2007年1-12月采用流式细胞术检测ITP患儿外周血淋巴细胞亚群水平,采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定血小板相关抗体（PA-Ig）,以了解ITP患儿机体免疫紊乱状态,探讨儿童ITP的免疫发病机制，报告如下。

抗人3型副流感病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及其活性鉴定

目的制备抗人3型副流感病毒核衣壳蛋白特异性单克隆抗体,为研发3型副流感病毒新型诊断试剂提供基础。方法利用重组克隆表达技术,获得可溶性的重组核衣壳蛋白;采用纯化的重组核衣壳蛋白免疫小鼠,采用杂交瘤技术制备抗人3型副流感病毒核衣壳单克隆抗体;采用ELISA及间接免疫荧光法筛选并鉴定可识别天然3型副流感病毒核衣壳蛋白单克隆抗体。结果获得9株分泌抗重组核衣壳蛋白的特异性单克隆抗体的细胞株,其中2株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体能识别天然的3型副流感病毒核衣壳蛋白。结论利用重组核衣壳蛋白作为免疫原制备出了识别天然核衣壳蛋白的单克隆抗体,并且具有较高的反应性。

基层儿童智力低下的病因初探

【目的】了解我国某农村地区儿童智力低下的病因,探索在基层开展智力低下(mental retardation,MR)病因诊断的可行性。【方法】对山西省吕梁地区2800个儿童进行智力筛查,MR确诊儿童进行体格检查、尿液筛查,问卷调查,部分患儿给予尿液色谱/质谱、染色体检查。【结果】共确诊237个MR患儿,男女比例为2.29∶1;其中MR病因明确者47例(19.8%),有重要诊断线索者81例(34.2%),病因不明者109例(46.0%);72名MR患儿同时伴有先天畸形,以耳发育畸形、小头畸形、多(少)指(趾)畸形为主,MR伴发畸形患儿倾向出现一些染色体病的面征:如丑陋面容、宽眼距等;33个有重要诊断线索MR患儿的染色体检查正常。【结论】在基层地区,结合病史、家族史、身体检查,可以对一部分MR患儿完成初步病因诊断,染色体检查仍是一些MR患儿的首选检查。

人甲3型流感病毒基质蛋白及其诱导抗体在临床检测中的应用

目的探讨抗重组人甲3型流感病毒基质蛋白(M1)抗体在临床检测中应用的可行性。方法在生物信息学分析的基础上,经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从人甲3型流感病毒感染细胞中获得目的基因,构建pET-28c(+)/IFV.M1P2重组质粒并在BL21DE3中诱导表达;重组蛋白经亲和层析纯化后免疫家兔制备多克隆抗体。采用间接免疫荧光法检测重组蛋白抗体与病毒感染细胞和临床标本的反应性,并与流感病毒凝血抑制试验结果比较分析,确定重组蛋白抗体的灵敏度和特异性。结果间接免疫荧光法检测抗M1P2重组蛋白抗体与人甲3型﹑甲1型流感病毒反应的抗体滴度可达1∶1200和1∶1000,与乙型流感病毒及其他呼吸道常见病毒无特异性反应。同样方法检测262例上呼吸道感染患儿鼻咽分泌物标本,阳性18例(6.87%),凝血抑制试验阳性24例(9.16%)。与凝血抑制试验相比,间接免疫荧光法检测敏感性为62.5%,特异性为98.7%。结论重组M1P2蛋白具有较强的免疫原性,可模拟天然病毒蛋白诱导产生较强的抗人甲3型流感病毒抗体,该抗体具有较高的反应特异性和一定的灵敏度。

建立小巨核细胞免疫酶标法在儿童血液病中的应用

目的建立常规的小巨核细胞免疫酶标染色方法,并讨论该方法对儿童血液病诊断及鉴别诊断中的应用意义。方法采用CD41单抗免疫酶标法检测儿童血液病患者骨髓涂片小巨核细胞。结果对照组小巨核细胞阳性率为25%,未见淋巴样小巨核细胞。不同疾病组比较,小巨核细胞和淋巴样小巨核细胞阳性率MDS组最高,AA组阳性率最低。结论与常规骨髓瑞特染色比较小巨核细胞免疫酶标染色可准确识别淋巴样小巨核细胞,有助于某些儿童血液病的鉴别和辅助诊断。

细菌革兰双重16S rRNA基因荧光定量PCR快速诊断妇产科菌血症

目的:用已知细菌革兰阴性、阳性菌双重16S r RNA基因荧光定量PCR方法(q-PCR)应用于妇产科患者菌血症的诊断,探讨该方法检测妇产专科患者菌血症的临床应用价值。方法:2013年1月~2014年12月对100例疑为全身感染处于菌血症状态的住院分娩孕产妇进行常规血液培养,同时用细菌革兰阴性、阳性菌双重16S r RNA基因q-PCR方法检测,分析2种方法诊断菌血症的阳性率、敏感性和特异性。结果 :通过q-PCR方法检测菌血症阳性率44%,血液培养阳性率16%,两者差异有统计学意义(P<0.01);菌血症临床诊断阳性率为37%,与q-PCR法阳性率存在显著性差异(P<0.01)。以血液培养阳性和(或)临床诊断菌血症的标准作为对照,q-PCR方法诊断敏感性为89.2%,特异性82.5%。结论:细菌革兰阴性、阳性菌双重16S r RNA基因q-PCR方法检测妇产科菌血症的阳性率高于血液培养,可快速为孕产妇患者感染提供早期、敏感的病原学诊断依据。

TGF-β和IGF-1信号通路调控肾母细胞瘤细胞增殖机制探讨

目的肾母细胞瘤是一种高发的儿童实体瘤,发病率占儿童恶性肿瘤8%~10%,多发生于<5岁儿童,有研究表明某些信号通路可调控其增殖过程。本研究探讨TGF-β和IGF-1信号通路是否共同参与调控肾母细胞瘤细胞的增殖过程。方法采用siRNA转染实验将TGFBR1-siRNA和IGF1R-siRNA转至肾母细胞瘤细胞株G401,以转染不同siRNA分为TGFBR1-siRNA组和IGF1R-siRNA组,siRNA无关序列(non-siRNA)转染组作为对照组,每组设6个复孔。MTS方法检测TGFBR1-siRNA和IGF1R-siRNA对细胞增殖率的影响,蛋白质印迹法检测TGF-β信号通路TGFBR1及下游蛋白p-ERK、SMAD2/3和p-AKT蛋白表达情况;蛋白质印迹法检测IGF-1信号通路IGF1R及下游蛋白p-AKT蛋白表达情况。ELISA法检测细胞上清中FGF9蛋白表达。结果抑制TGFBR1和IGF1R72和96h后,细胞的增殖率受到抑制,对照组增殖率设为100%。与其相比,转染TGFBR1-siRNA 72h后的实验组和对照组的增殖率分别为(80±14)%和(100±7)%,实验组低于对照组,P=0.034;转染IGF1R-siRNA 72h后实验组和对照组的增值率分别为(85±21)%和(100±7)%,实验组低于对照组,P=0.028。转染TGFBR1-siRNA 96h后的实验组和对照组的增殖率分别为(81±13)%和(100±11)%,实验组低于对照组,P=0.021;转染IGF1R-siRNA 96h后实验组和对照组的增殖率分别为(82±17)%和(100±11)%,实验组低于对照组,P=0.038。抑制TGFBR1后,与non-siRNA组相比,下游蛋白FGF-9、p-ERK、SMAD2/3和p-AKT明显受到抑制。TGFBR1-siRNA转染72h后,实验组细胞上清中FGF9蛋白表达量显著下降,实验组为(533.85±54.64)ρg/mL,对照组为(587.34±46.83)ρg/mL,P=0.041;96h后实验组FGF9蛋白表达量仍显著低于对照组,实验组为(495.03±59.26)ρg/mL,对照组为(605.34±49.28)ρg/mL,P=0.018。TGFBR1-siRNA转染48h后,p-ERK、SMAD2/3和p-AKT蛋白表达量出现降低;72h后,p-ERK和SMAD2/3蛋白表达量仍降低。与non-siRNA转染对照组相比,IGF1R-siRNA转染72和96h后,p-AKT蛋白表达量出现降低。结论TGF-β和IGF-1信号通路共同参与肾母细胞瘤细胞的增殖,两条信号通路可能通过共同的下游蛋白AKT参与对肾母细胞瘤增殖的调控,TGFBR1和IGF1R可以作为肾母细胞瘤治疗的靶点深入研究。

重症肺炎链球菌感染患儿淋巴细胞亚群与血清免疫球蛋白及其亚类表达的变化

目的探讨重症肺炎链球菌感染患儿淋巴细胞亚群与血清免疫球蛋白及IgG亚类水平的变化。方法收集2009年1月-2010年1月在首都儿科研究所呼吸科住院的27例重症肺炎链球菌肺炎婴幼儿为病例组,65例健康儿童为健康对照组。分别采用流式细胞仪与散射比浊法测定二组儿童细胞免疫(C;;DOI:10.3969/j.issn.3+、C;;DOI:10.3969/j.issn.3+C;;DOI:10.3969/j.issn.4+、C;;DOI:10.3969/j.issn.3+C;;DOI:10.3969/j.issn.8+、C;;DOI:10.3969/j.issn.4+/C;;DOI:10.3969/j.issn.8+、C;;DOI:10.3969/j.issn.19+、NK细胞)与体液免疫(IgG、IgA、IgM)及IgG亚类(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)水平。结果 1.与健康对照组比较,病例组患儿外周血C;;DOI:10.3969/j.issn.3+C;;DOI:10.3969/j.issn.4+数量降低(t=0.000,P<0.05),C;;DOI:10.3969/j.issn.3+C;;DOI:10.3969/j.issn.8+(t=0.000,P<0.05)、C;;DOI:10.3969/j.issn.4+/C;;DOI:10.3969/j.issn.8+(t=0.013,P<0.05)、IgA(t=0.004,P<0.05)、IgM(t=0.000,P<0.05)、IgG2(t=0.018,P<0.05)显著升高。2.病例组患儿中检出IgG亚类缺陷11例(占40.74%),以IgG2、IgG4缺陷为主。3.与健康对照组比较,11例IgG亚类缺陷患儿C;;DOI:10.3969/j.issn.3+C;;DOI:10.3969/j.issn.4+(t=0.006,P<0.05)、C;;DOI:10.3969/j.issn.4+/C;;DOI:10.3969/j.issn.8+(t=0.015,P<0.05)均显著降低,C;;DOI:10.3969/j.issn.3+C;;DOI:10.3969/j.issn.8+(t=0.013,P<0.05)、NK细胞计数(t=0.045,P<0.05)均显著升高。结论重症肺炎链球菌感染患儿存在细胞免疫和体液免疫紊乱以及IgG亚类缺陷。

冠状动脉扩张型川崎病患儿淋巴细胞亚群与体液免疫状况分析

目的探讨川崎病(KD)患儿冠状动脉扩张型淋巴细胞亚群与体液免疫变化对诊断、用药、疗效及预后的意义。方法以2000年6月-2007年12月在首都儿科研究所住院的171例(年龄4个月～9岁)KD患儿为研究对象,65例(年龄5个月～7岁)健康儿童为健康对照组。分别采用流式细胞术与散射比浊法测定其外周血淋巴细胞亚群[CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD19+、自然杀伤(NK)细胞]与血清免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM)水平变化,分析二者间的差异,同时对KD患儿中冠状动脉扩张型(53例)及冠状动脉不扩张型患儿进行比较。结果与健康对照组比较,KD患儿急性期外周血CD3+(t=0.01P<0.05)、CD3+CD4+(t=0.02P<0.05)显著下降,CD3+CD8+(t=0.00P<0.05)、CD4+/CD8+(t=0.00P<0.05)、CD19+(t=0.00P<0.05)、IgG(t=0.00P<0.05)、IgA(t=0.00P<0.05)、IgM(t=0.00P<0.05)显著升高,而NK细胞水平无显著变化(t=0.46P>0.05)。冠状动脉扩张型与冠状动脉不扩张型淋巴细胞亚群及体液免疫比较,CD4+/CD8+(t=0.02P<0.05)、CD3+CD8+(t=0.04P<0.05)、IgG(t=0.03P<0.05)有显著性差异。结论KD患儿急性期存在淋巴细胞亚群与体液免疫调节功能紊乱,CD4+/CD8+比值下降,CD3+CD8+、IgG水平升高的患儿,其冠状动脉扩张的发生率增加,预后不良。

TGFBR1和FGF9蛋白参与miRNA-140-5p调控肾母细胞瘤细胞的增殖过程

目的本研究拟探讨miRNA-140-5p在肾母细胞瘤增殖过程中的调控作用以及TGF—BR1和FGF9蛋白参与此过程的作用机制。方法采用miRNA芯片技术分析肾母细胞瘤患儿肿瘤组织和瘤旁正常组织的miRNA表达谱，结合生物信息学预测和文献报道，选取表达差异显著的miRNA-140-5p作为研究对象，扩大样本进行Real-time PCR验证；MTS方法检测miRNA-140—5p对细胞增殖率的影响；双荧光素酶实验验证miRNA-140—5p的直接下游靶基因；Western-blot法检测TGF—BR1蛋白表达；ELISA法检测细胞上清中FGF9蛋白表达。结果发现与瘤旁组织相比，miRNA-140—5p在肾母细胞瘤组织和瘤旁正常组织的相对表达量分别为1．69±0．83和6．37±3．25，肾母细胞瘤组miRNA-140-5p的表达量明显降低（P〈0．05）。在肾母细胞瘤细胞株G401及SK-NEP-1中，发现过表达miRNA-140-5p可有效降低G401及SK-NEP-1的增殖率，将miRNA无关序列（miRNA-con）转染组细胞增殖率设为100％，与其相比，转染miRNA-140-5p的G401细胞组的增殖率为（87±15）％比（100±20）％，SK-NEP-1细胞组为（91±12）％比（100±9）％，组间比较，差异均有统计学意义（P值均〈0．05）。利用生物信息学软件对miRNA-140—5p直接下游靶基因进行预测，结合肾母细胞瘤相关基因，选择TGFBR1和FGF9基因为miRNA-140—5p的直接下游靶基因；通过双荧光素酶实验证实miRNA-140—5p可直接靶向TGFBR1和FGF9基因。将miRNA-con转染组TGFBR1蛋白表达量设为1，与其相比，过表达miRNA-140-5p的G401及SK-NEP-1细胞内，TGFBR1蛋白表达量降低（G401细胞降为0．67；SK-NEP-1细胞降为0.87）（P〈0．05）。与miRNA-con转染对照组相比，G401及SK-NEP-1细胞上清中FGF9蛋白表达量下降，G401组为（478．66±66．32）pg／ml比（535．64±78．53）pg／ml，SK-NEP-1细胞组为（486．57±71．01）pg／ml比（601．26±77．68）pg／ml，组间比较，差异均有统计学意义（P值均〈0.05）。结论患儿肾母细胞瘤中miRNA-140-5p表达量低于瘤旁正常组织，miRNA-140—5p影响肾母细胞瘤细胞的增殖，TGFBR1和FGF9蛋白可能参与了miRNA-140—5p调控肾母细胞瘤细胞增殖的过程。