北京地区人偏肺病毒膜表面糖蛋白G编码基因和特征的分析

为了解北京地区人偏肺病毒（hMPV）膜表面糖蛋白G编码基因的特征，提取2003年和2004年各6份hMPV阳性的临床呼吸道标本中的RNA，经用随机引物合成cDNA后，用特异性引物扩增G蛋白全基因，克隆至pBST载体中并进行测序。用生物软件与GenBank中hMPV的基因序列进行比较和种系进化分析。12株hMPV可以分为两个主要的进化簇1和2。每个进化簇还可以再分为不同的亚进化簇。3株（2003年）hMPV属于进化簇1；9株（3株2003年和6株2004年）hMPV属于进化簇2。这12株hMPV G蛋白基因的核苷酸长度在624～711nt，使用了两种不同的终止密码，编码的氨基酸长度为208～236aa，蛋白质分子量为22．9～25．8kD。与进化簇2相比，进化簇1的3株hMPV都出现了3个核苷酸的缺失，但未改变读码框架。同一进化簇内的hMPV G蛋白基因核苷酸和氨基酸的同源性分别为95．7％～100％和91．8％～100％，不同进化簇间的核苷酸和氨基酸的同源性分别为56．3％～57．4％和34．3％～38．2％。疏水性分析表明这12株hMPV G蛋白是典型的Ⅱ型跨膜锚定蛋白，分别与两个进化簇代表株的疏水图一致。这些hMPV的G蛋白氨基酸的替换集中在胞外区。它们都含有高百分比的脯氨酸（P）、丝氨酸（S）和苏氨酸（T），含有相当数量的位于胞外区的O-连接糖基化化点。这些hMPV的G蛋白的N连接糖基化位点数目和位置不尽相同。通过对G蛋白基因的分析显示，2003年和2004年北京地区流行的hMPV分属于两种不同的进化簇。基因分析品示hMPV的G蛋白是高精基化的膜表面蛋白，具有与同属于副粘病毒科、肺病毒亚科的人呼吸道合胞病毒（hRSV）的G蛋白相似的基因特征，推测其功能和在感染免疫中的作用相当于hRSV的G蛋白，但有待进一步深入研究予以证实。

北京地区人呼吸道合胞病毒核蛋白基因的序列分析及原核表达

为了解北京地区流行的人呼吸道合胞病毒（HRSV）N蛋白基因的特征，并用大肠杆菌表达获得N蛋白，从2006年1月至3月收集的首都儿科研究所附属儿童医院急性呼吸道感染患儿标本中分离到7株HRSV毒株（3株A亚型，4株B亚型），分别经RTPCR扩增得到HRSVN蛋白全基因，克隆至pUCm—T载体中并进行测序和分析；从重组质粒pUCm—N9968中经PCR扩增获得N基因，亚克隆人原核表达载体pET30a（＋）中，得到重组表达质粒pET30a—N9968，转化大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导培养；SDS-PAGE和Westernblot检测目的蛋白的表达和抗原性。经扩增并测序，7株HRSVN蛋白基因全长均为1176bp，编码一个含391个氨基酸的蛋白；北京地区7株RSV分离株的N蛋白基因之间的核苷酸和推导的氨基酸同源性分别在85．4％～99．7％之间和95．4％～100％之间，进一步证明N蛋白基因的高度保守性。经诱导培养产生大量带6个组氨酸标记的重组N蛋白，主要以包涵体形式存在。N蛋白粗提物经Ni^2＋亲和层析获得较理想纯化。Westernblot结果显示，所表达的蛋白能与特异性单克隆抗体和人血清反应。说明本研究构建的重组pET30a-N9968原核表达质粒使N蛋白获得了高效表达，并且具有特异的抗原活性，为今后进一步研究奠定了基础。

近来北京市某些医院院内感染性腹泻与Noro病毒相关

2006年11月上中旬，北京市某些综合医院内老年病科和心脏外科术后的一些住院患者先后发生腹泻、呕吐，因患者症状相似，疑为院内感染；细菌学检测的结果基本可以排除细菌感染，希望进一步做病毒病原学检测。

北京地区部分儿童严重急性呼吸综合征的血清学研究

目的 确定临床诊断为严重急性呼吸综合征（SAILS）患儿感染的病原是否为SAILS相关冠状病毒（SAILS-CoV）；同时探讨儿童sARS患者的传播能力。方法2003年6-8月收集到的SAILS患者及其接触者血清标本177例，同时期的来源于非疫区择期手术儿童血清标本49例，以及无SAILS接触史的北京健康儿童血清标本93例，SAILS流行前儿童血清标本90例，总计409例。应用不同方法（包括酶联免疫吸附实验、间接免疫荧光、Western-blot等）、不同单位生产的试剂盒测定抗SAILS-CoV抗体。结果不同检测方法中，SAILS．CoV特异性IgG抗体阳性率在SAILS患儿中为39．1％-43．5％。成人SAILS患者中为57．1％-71．4％；与SAILS患儿接触的儿童中均为阴性。与SAILS患儿接触的成人中为6．0％-9．0％；与成人SAILS接触的儿童中为0-9．7％；与成人SAILS接触的成人中为4．4％-7．1％；同时期的正常儿童与非疫区择期手术儿童以及SAILS流行前的正常儿童血清标本用不同方法和试剂检测结果不尽相同。结论临床诊断为SAILS的患儿SAILS-CoV特异性IgG抗体阳性率（40％左右）明显低于临床诊断为SAILS的成人患者。提示在流行期间有相当一部分儿童sARS实际上是由其他的呼吸道病毒感染所致。与成人sARS接触的儿童和成人中，有一部分SAILS抗体为阳性，提示可能存在SAILS-CoV的隐性感染。目前已推广使用的SAILS诊断试剂对于儿童SAILS诊断的正确性还需要进一步的验证。

北京地区人群中人偏肺病毒血清抗体水平的初步调查

目的通过对人类偏肺病毒(hMPV)特异性IgG抗体检测,初步了解北京地区人群中该病毒感染的状况.方法以大肠杆菌表达的hMPV 核蛋白(N蛋白)为抗原,用Western-blot检测随机选取的116例血清标本中hMPV N蛋白特异性IgG抗体,以确定表达的hMPV N蛋白的抗原特异性. 随后对1996年4月至1997年3月自首都儿科研究所附属儿童医院和北京宣武医院采集的门诊非呼吸道感染患者及正常儿童的体检血清710例进行hMPV N蛋白特异性IgG抗体检测.结果hMPV N蛋白的抗原特异性试验证明表达的hMPV的N蛋白特异性好.本组710份血清中,抗hMPV N蛋白IgG抗体总阳性率为17.2%(122/710).其中<1个月的婴儿抗体阳性率为13.2%,1个月～的婴儿中抗体阳性率下降至6.1%,2个月～的婴儿中抗体阳性率降至最低(3.1%),6个月～的婴儿中抗体阳性率上升至13.9%,在随后的几个年龄段内抗体阳性率维持在13.0%左右,30岁以后的人群中抗体阳性率有所升高,30岁～人群中达28.1%,40岁～人群中达32.3%,≥50岁的人群中达38.5%.结论研究中所应用的hMPV N蛋白的抗原特异性好;抗体的检测结果提示在北京地区的人群中hMPV的感染并不少见,血清抗体阳性率低的年龄组与文献报道感染发生率高的年龄组相符.

病毒性疾病防治需要规范病原学诊断

人们对病毒性疾病的危害已有共识，不断发展的新技术使得病毒病原的检测和确定变得更加敏感、特异且快速。病毒病原的诊断和确定由于临床医学和药物研究的发展和需求显得越来越重要，如何选择诊断方法，是正确诊断病原的关键。在当前病毒性疾病防治工作中，亟须规范、高质量、有批准文号、可用于临床实验室的病原学诊断试剂盒的面世。

人源抗呼吸道合胞病毒基因工程单克隆抗体Fab段基因的筛选和表达

目的采用噬菌体表面呈现和重组抗体技术构建人噬菌体抗体基因库，筛选获得人源抗呼吸道合胞病毒（RSV）Fab段基因并在原核细胞中表达。为研制安全、有效的预防和治疗RSV感染的制剂奠定基础。方法从RSV感染患儿恢复期外周血淋巴细胞中提取细胞总RNA，用一组人IgGF出特异性引物，通过RT—PCR扩增得到一组轻链（κ和λ）和重链Fab段基因，并将此轻链和重链基因片段克隆于pComb3噬菌体载体，电转化XL1-Blu菌构建成抗RSV噬菌体抗体基因库。用纯化病毒颗粒作抗原对此抗体库进行了富集筛选，得到了特异性针对RSV的人源单克隆抗体Fab段基因，并在大肠杆菌中获得有效表达。用ELISA方法检测了此Fab抗体的抗原特异性，并对阳性克隆进行了基因序列分析。结果所构建的抗体库库容为108，从此抗体库中筛选得到的阳性克隆所表达的Fab抗体能与RSV纯化抗原特异性结合，保留了对RSV的抗原特异性。核苷酸序列分析证实，所获得的阳性克隆基因为人源IgG基因。结论本实验获得了特异性抗RSVFab抗体基因并在大肠杆菌中获得表达，表达产物能与RSV抗原特异性结合。