糖基因GLT25D2敲除小鼠的制备与基因型鉴定

目的建立GLT25D2基因敲除小鼠模型，为胶原糖基化修饰分子机制研究奠定工作基础。方法采用胚胎干细胞线性打靶技术，获得同源重组的干细胞，繁殖嵌合体，GLT25D2^＋/-小鼠杂交获得GLT25D2^-/-纯合子小鼠。采用PCR技术对小鼠进行基因型鉴定。结果共获得Founder小鼠4只，其中雄性和雌性各2只。经过8个月的配笼繁殖，共获得GLT25D2一小鼠40只；GLT25D2^＋/-小鼠89只；GLT25D2^-/-小鼠34只。不同基因型比例符合孟德尔遗传规律。对不同基因型小鼠合笼配对观察发现，GLT25D2^-/-小鼠生育功能下降，每胎数量平均3～4只，显著少于GLT25D2^＋/-小鼠之间的每胎小鼠数（平均6～8只）。对20，40，以及60d小鼠的体重观察显示，GLT25D2^-/-小鼠体重显著高于GLT25D2^＋/-和GLT25D2^＋/＋型小鼠，但这种体重差异的趋势随小鼠年龄的增加而逐渐减少。结论GLT25D2基因敲除小鼠发育异常，与野生型小鼠相比，体重增加，繁殖功能降低。

肝细胞脂肪变对血清糖蛋白GP73水平的影响

目的观察不同病因肝细胞脂肪变对肝病患者血清GP73水平的影响。方法以100例健康体检者为对照，观察178例肝穿刺病理学检查发现肝脂肪变性患者的血清GP73水平差异。结果与健康对照人群（35．61±12．22ng／m1）相比，不同病因导致的脂肪肝患者（70．62±60．60ng／m1）血清GP73显著升高。尽管酒精性脂肪肝（81．86±47．82ng／m1）和急性肝损伤患者合并肝细胞脂肪变（82．77±77．73ng／m1）血清GP73水平略高于慢性乙型肝炎患者（63．84±50．62ng／ml）和非酒精脂肪肝患者（65．75±62．20ng／ml），但不同病因导致的肝细胞脂肪变并未显示血清GP73水平差异有统计学意义。更为重要的是，68例，≥1．0（71．46±66．48ng／ml），75例F≥2．0（69．58±62．31neVml），以及34例F3·F4的患者（71．65±43．89ng／ml），血清GP73的水平差异无统计学意义（F=0．02，P=0．98）。相反，显著性肝纤维化S〉-2患者（91．04±82．37ng／m1）其血清GP73水平显著高于纤维化轻微S〈2（65．80±53．45ng／m1）的患者（P=0．029）。结论肝细胞脂肪变导致血清GP73水平显著升高，但肝细胞脂肪变的程度似乎与血清GP73水平无关。

Colgalt2-酶联免疫试剂盒的制备

目的 利用N末端Colgalt2多克隆抗体和C末端Colgalt2多克隆抗体,制备Colgalt2双抗体夹心酶联免疫试剂盒.方法 体外扩增Colgalt2的N-末端编码序列,构建其原核表达质粒,诱导纯化Colgalt2重组蛋白.免疫大耳白兔获得抗Colgalt2 N-末端重组蛋白的多克隆抗体.以Colgalt2 N-末端重组蛋白为抗原,利用ELISA和Western Blot技术检测多克隆抗体效价和特异性.以Colgalt2 N-末端多克隆抗体包被酶标板,同时利用HRP标记的C末端Colgalt2抗体,制备Colgalt2-ElISA试剂盒.结果 我们成功克隆表达了N末端Colgalt2基因片段,制备了兔抗Colgalt2多克隆抗体,ELISA分析表明该抗体效价较高（＞1∶1 280000）,Western Blot分析显示该抗体有良好的特异性.对我们所制备的不同浓度的Colgalt2重组蛋白进行分析显示,所制备的分析试剂盒,在1.25～25 μg/ml范围内具有较好分析线性.线性相关系数约为0.98.结论 所制备的Colgalt2-ELISA分析试剂盒可以用于标本内Colgalt2蛋白检测.

敲除Colgalt2基因加重小鼠急性肝损伤

目的：初步探讨Colgalt2基因介导的胶原Glcα1，2 Galβ1？糖基化修饰在急性肝损伤过程中的作用。方法取60只Colgalt2＋／＋小鼠和60只Colgalt2－／－小鼠进行急性肝损伤实验，雌雄各半。每组随机选取20只小鼠腹腔注射CCl4（CCl4∶橄榄油＝2∶7，20 ml／kg）。观察小鼠死亡情况，并绘制生存曲线。每组剩余40只小鼠随机分为0、4、8、12 h组，每组10只，腹腔注射CCl4（剂量同上）。分别于0、4及8 h各处死6只小鼠，之后将4及8 h组剩余的小鼠均纳入12 h组（ Colgalt2＋／＋小鼠， n＝14； Colgalt2－／－小鼠， n＝16），并于12 h处死小鼠。 HE染色观察肝组织的病理学改变，取血清进行生化指标ALT、 AST测定。利用qRT？PCR和Western印迹技术检测小鼠Colgalt2在基因及蛋白水平的表达情况。结果Colgalt2基因在Col？galt2＋／＋小鼠肝组织内表达，而在Colgalt2－／－小鼠肝组织内不表达。注射CCl4后10 h， Colgalt2＋／＋小鼠死亡率为35％， Colgalt2－／－小鼠死亡率为70％，两组小鼠死亡率差异显著（P＜0．05）。注射CCl4后12 h， Colgalt2＋／＋小鼠死亡率达50％， Colgalt2－／－小鼠死亡率为70％，差异不显著（P＞0．05）。肝功检测及HE染色结果均提示，与Colgalt2＋／＋小鼠相比， Colgalt2－／－小鼠肝损伤较重。注射CCl4后，野生型小鼠Colgalt2在RNA水平和蛋白水平表达下调。结论 Colgalt2基因敲除在一定程度上可加重小鼠急性肝损伤。该观察结果提示， Colgalt2基因介导的胶原Glcα1，2 Galβ1？糖基化修饰可能与肝损伤的修复有关。

高剂量O-糖基化修饰抑制剂Benzyl-α-GalNAc诱导体外培养肝细胞脂肪变

目的初步探讨蛋白质O-糖基化抑制剂Benzyl-α-GalNAc对肝细胞的影响。方法取雌性Balb／c小鼠（8～10周）20只随机分为正常组（n=10），Benzyl—d—GalNAc药物组（n=10），给Benzyl-α-GalNAc药物（5mg／kg，1次／d）灌胃。第2周末取小鼠血清及肝脏进行血清生化指标AIJT及AlJP测定及肝组织HE染色。培养HepG2细胞．Benzyl-α-GalNAc分别以0．5、1及5mg／ml与HepG2细胞共孵育。24h后进行油红O染液染色。5mg／ml药物组完全未贴壁，去除处理因素，继续培养12h观察细胞。Benzyl-α-Gal—NAc以3mg／ml处理HepG2细胞12h及24h观察细胞贴壁情况。培养L02细胞，Benzyl-α-GalNAc分别以0．1及0．5mg／ml与L02细胞共孵育。24h后进行油红O染液染色。结果药物组与正常对照组比较，肝组织切片显示轻微脂肪变。油红O染色显示药物处理组HepG2及L02细胞内的脂滴积聚。高浓度组细胞完全没有贴壁，24h后更换无药物培养基，去除处理因素12h后，可见HepG2开始贴壁生长。结论高浓度O-糖基化抑制剂Benzyl-α-GalNAc抑制体外肝细胞的黏附，并诱导轻微肝细胞脂肪变。