大鼠创伤性脑损伤后认知行为的变化

目的建立直接手术损伤大鼠部分脑皮质及海马CA1区的创伤性脑损伤模型，并观察损伤后动物认知行为的改变情况。方法将大鼠进行脑损伤建模后，于术后11—15d和26—30d采用Morris水迷宫的方法评价动物的认知行为变化后，灌杀动物取脑切片，HE染色及尼氏染色观察损伤范围；胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫组织化学染色观察星型胶质细胞（AST）的活化及胶质瘢痕形成情况；术后5d行Nestin及GFAP双重免疫荧光染色显示海马内干细胞的激活，并观察损伤边缘的干细胞迁移情况。结果直接手术损伤部分脑皮质及海马CA1区后，造成了动物认知功能障碍，并且1个月时有自发的认知功能恢复；5d时星型胶质细胞活化，1个月时胶质瘢痕的形成。结论本实验采用的模型可成功造成动物认知行为的改变，为组织工程材料的移植治疗脑损伤提供了比较适用的研究模型。

人PINK1抗血清的制备及其免疫活性物质在大鼠脑组织中的表达

目的制备帕金森病相关蛋白PINK1抗血清并检测其在大鼠脑组织中的表达特征。方法制备人PINK1基因重组蛋白,免疫新西兰大耳白兔获得抗PINK1抗血清;通过盐析法初步纯化、Western blotting法鉴定抗血清的敏感性和特异性、免疫组化法检测PINK1在大鼠脑中的分布。结果人PINK1基因重组蛋白以包涵体形式在大肠杆菌中高效表达;纯化蛋白制备兔抗血清经盐析纯化后,兔抗人PINK1抗血清特异性识别人PINK1基因重组蛋白及大鼠脑匀浆中40000和66000的蛋白质,与预期结果一致;免疫组化染色显示PINK1广泛分布在嗅球、皮质、海马、纹状体、小脑、黑质和红核。结论制备了一种兔抗人PINK1多克隆抗血清;PINK1广泛分布于大鼠中枢神经系统;为以后深入研究PINK1表达的组织分布、细胞内定位及其生物学功能提供了有效地实验工具。

帕金森病模型大鼠中脑黑质磷酸化α-突触核蛋白表达增加

目的观察鱼藤酮对大鼠中脑黑质磷酸化α-突触核蛋白(α-SYN)、酪氨酸羟化酶(TH)表达的影响。方法利用脑立体定位技术注射微量鱼藤酮,建立急性损伤帕金森病(PD)模型。采用动物行为轨迹分析软件计算各时间点30min内运动距离和平均运动速度。免疫组织化学检测黑质(SN)部位TH、磷酸化α-SYN的表达,并统计TH和磷酸化α-SYN阳性神经元数目。结果PD组动物各时间点30min内运动距离、平均运动速度低于对照组(P<0.05,0.01)。同对照组相比,损伤侧SN部位TH阳性神经元数目明显减少(P<0.01),磷酸化α-SYN阳性神经元数目明显增加(P<0.01)。结论PD大鼠中脑黑质磷酸化α-SYN表达增加及TH的表达明显下降,并出现运动障碍。

AAV-GDNF/TH双基因载体的构建及表达

目的探讨构建于同一个重组腺相关病毒(rAAV)载体上的酪氨酸羟化酶(TH)基因和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因是否能够同时表达。方法应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测双基因在HEK293包装细胞中的转录;通过免疫细胞化学荧光染色和免疫组织化学染色技术分别检测双基因在体外培养大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)和大鼠脑中的表达。结果在HEK293包装细胞和BMSCs中分别同时检测到了GDNF和TH基因RNA和蛋白的表达。对照LacZ在HEK293包装细胞和骨髓基质细胞中的表达率分别为50%和15%。大鼠脑组织切片中注射AAV-GDNF/TH病毒的部位与注射PBS的对侧相比无论是GDNF还是TH的表达均显著增加(P<0.01)。结论构建于同一个rAAV载体上的TH基因和GDNF基因体内体外都能够同时表达,此结果为PD的基因治疗提供了新的依据。

Nrf3通路参与星形胶质细胞对抗鱼藤酮毒性的保护作用

目的:寻找星形胶质细胞在对抗由鱼藤酮导致的氧化应激中发挥保护作用的相关分子并探讨其作用机制。方法:小鼠多巴胺能MN9D细胞分别在星形胶质细胞条件培养液(ACM)与星形胶质细胞用新鲜培养基中培养24小时后加入鱼藤酮作用48小时。细胞计数,评价星形胶质细胞条件培养液对MN9D细胞的保护作用。利用基因芯片技术寻找MN9D细胞在ACM处理后发生表达上调或下调基因,并对这些基因进行分析,找出有意义基因。结果:在不同作用时间和鱼藤酮浓度梯度下,经过ACM处理的MN9D细胞活性显著高于在普通培养基中培养的细胞。初步得到104个差异表达基因,其中62个表达上调基因,42个表达下调基因。这些基因主要与凋亡、肿瘤、细胞周期、代谢、信号转导、转录调节、翻译调节和传递蛋白等相关。对其中的Atp5a1,Nrf3基因进行分析,发现Nrf3通路参与了ACM的保护作用。结论:ACM能保护MN9D细胞抵抗鱼藤酮所致的细胞毒性,Atp5a1,Nrf3,GCL,NQO1等基因经ACM处理后发生差异表达,可能是星形胶质细胞保护作用的部分下游信号通路。