仅采用PCR进行分子克隆的方法探索

目的针对目前各种费时且易失败的克隆方法和价格昂贵的试剂盒等问题,对一种仅采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)分子克隆方法进行了探索。方法利用高保真的DNA聚合酶具有3’-核酸外切酶活性的特点,采用PCR把载体和插入片段扩增出来,二者的扩增产物先加限制性内切酶Dpn I后再按一定比例混合来消化甲基化的DNA模板,最后把Dpn I消化产物直接转化到感受态细胞来得到克隆基因。结果是一种简单、高效、可靠、且仅采用PCR的分子克隆方法,并利用此方法成功地把构建在载体p ET上的α-突触核蛋白全长基因和构建在p CDNA3.1上的乙酰胆碱受体亚基的全长基因分别重新构建在载体p GEX-4T-1和p GEMHE上。结论在PCR扩增时能够通过引物设计来确定克隆位点,所以该方法可以把任何DNA片段插入到质粒载体内的任何位置,而不需要考虑载体多克隆位点限制的问题。此外,该方法省去了传统的酶切消化、纯化回收和连接过程。

冠心病气虚血瘀证大鼠模型的建立

应用疲劳跑步运动复合左冠状动脉前降支高位结扎的方法建立冠心病气虚血瘀证病证结合大鼠模型。该实验选用Wistar雄性大鼠,随机分为假手术组（JSS）、单纯结扎冠脉组（DZ）、疲劳跑步运动复合结扎冠脉组（PZ）。DZ组进行单纯冠脉结扎;PZ组利用小动物跑台进行为期2周的跑步运动造成疲劳模型,在此基础上进行冠脉结扎,术后以1次/2 d的频率维持28 d的力竭跑步;于术后28-31 d观察大鼠宏观体征,分别采集大鼠超声心动检测指标、呼吸幅度对大鼠冠心病气虚血瘀证的主症进行评价;采集空场实验相关指标、力竭运动时间、足底图像色彩饱和度对兼症进行评价;采集舌面色彩饱和度对舌象进行评价;采集脉搏搏动幅度对脉象进行评价。同时对血液流变学、凝血功能等指标进行检测。结果显示,术后第28天开始,PZ组大鼠主症、兼症、舌象、脉象均符合冠心病气虚血瘀证证候表现,结合相关病理性检测结果证明以疲劳跑步运动复合左冠状动脉前降支高位结扎的方法在大鼠体内可以成功建立冠心病气虚血瘀证病证结合模型。

4种冠心病气虚血瘀证大鼠模型建立方法的比较

对单纯结扎冠状动脉、控制饮食复合结扎冠状动脉、疲劳跑步复合结扎冠状动脉、控制饮食+疲劳跑步双因素复合结扎冠状动脉4种方法建立的冠心病气虚血瘀证病证结合大鼠模型进行比较。该实验选用Wistar雄性大鼠,随机分为假手术组(SHAM)、单纯结扎冠脉组(L)、控制饮食复合结扎冠状动脉组(DL)、疲劳跑步复合结扎冠状动脉组(EL)、控制饮食+疲劳跑步双因素复合结扎冠脉组(DEL)。L组进行单纯冠脉结扎;DL组通过2周控制饮食造成脾胃气虚为主的全身气虚大鼠模型,在此基础上结扎冠脉,术后继续控制饮食;EL组通过2周跑台运动造成大鼠全身气虚模型,在此基础上进行冠脉结扎,术后以1次/2 d的频率维持力竭跑步;DEL组通过2周控制饮食、跑台运动造成大鼠全身气虚模型,在此基础上进行冠脉结扎,术后继续控制饮食并以1次/2 d的频率维持力竭跑步;于术后4周观察大鼠宏观体征,分别采集大鼠超声心动检测指标、呼吸幅度对大鼠冠心病气虚血瘀证的主症进行评价;采集空场实验相关指标、力竭运动时间、足底图像色彩饱和度对兼症进行评价;采集舌面色彩饱和度对舌象进行评价;采集脉搏搏动幅度对脉象进行评价。同时对脑钠肽、内皮素等指标进行检测。结果显示术后4周,通过疲劳运动复合结扎冠脉方法建立的模型与其他3种方法建立的模型比较与临床病因学基础以及与中医相关理论体系的联系更密切,在完整体现中医证候的特征方面具有一定的优势,更符合临床实际发病的原因与特征,是一种条件可控、重复性好的冠心病气虚血瘀证病证结合大鼠模型。

双参通冠方对冠心病气虚血瘀证大鼠的干预作用

目的:研究双参通冠方对疲劳运动复合结扎冠脉方法建立的冠心病气虚血瘀证大鼠模型不同阶段的干预作用。方法:雄性Wistar大鼠,随机分为空白组、假手术组、模型组、药物干预组。利用疲劳运动复合结扎冠脉的方法建立冠心病气虚血瘀证模型。在造模2、4、6周时分别对大鼠的主症、兼症、舌象、脉象进行评价,对脑钠肽、内皮素等指标进行检测同时观察相关组织病理性改变。结果:在不同时间点模型组与对照组比较,体质量、一氧化氮含量下降(P<0.01),脑钠肽、N端脑钠肽前体、内皮素含量升高(P<0.01);药物干预组与模型组比较体质量、一氧化氮含量升高(P<0.01),脑钠肽、N端脑钠肽前体、内皮素含量下降(P<0.01),组织病理性改变及证候表现得到改善。结论:双参通冠方对冠心病气虚血瘀证大鼠心脏功能、运动耐受力、血管内皮功能等均有一定程度的改善。