活性氧自由基清除剂EUK-134对脑缺血再灌注损伤大鼠线粒体相关蛋白PGC-1α和VDAC1的影响

目的 研究活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)清除剂Eukarion-134 (EUK-134)对大脑中动脉梗死(middle cerebral artery occlusion, MCAO)再灌注大鼠脑内线粒体生物发生相关蛋白——过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子-1α(peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator-1α,PGC-1α),以及线粒体电压依赖性阴离子通道1(voltage-dependent anion channel 1,VDAC1)的影响,探讨脑缺血后ROS含量变化对线粒体结构和功能的影响。方法 将健康雄性SD大鼠采用随机数字表法分为3组:假手术(Sham)组、MCAO组和MCAO+EUK-134 (EUK-134)组,每组6只。使用改良线栓法构建大鼠中动脉梗死模型,模拟缺血90 min后拔出线栓进行再灌注24 h。手术期间持续监测大鼠心率、平均动脉压以及肛温,确保其生理指标维持在正常范围内。EUK-134组大鼠通过皮下注射的方式注射EUK-134(10 mg/kg),Sham及MCAO组大鼠给予等体积溶剂。采用Western blotting法检测大鼠缺血脑组织中PGC-1α的表达。应用免疫荧光染色检测大鼠脑缺血半暗带区VDAC1的表达,利用氧化感应荧光探针(2′,7′-dichlorofluorescin diacetate, H2DCF-DA)染色法标记ROS阳性细胞,并将VDAC1与ROS进行荧光双标染色。结果 (1) MCAO组大鼠再灌注24 h缺血侧脑组织PGC-1α蛋白水平比Sham组明显降低(P<0.05);与MCAO组相比,EUK-134组缺血侧脑组织PGC-1α蛋白水平明显升高(P<0.05)。(2)与Sham组相比,MCAO组大鼠再灌注24 h缺血半暗带区VDAC1阳性细胞数量明显增多(P<0.05),而给予EUK-134处理的脑缺血再灌注大鼠缺血半暗带区VDAC1阳性细胞数量显著低于MCAO组(P<0.05)。VDAC1与神经元标志物NeuN共定位。(3)在MCAO组大鼠缺血半暗带区,VDAC1阳性细胞与ROS共定位,且VDAC1/ROS双阳性细胞数量显著高于Sham组(P<0.05),给予EUK-134的缺血大鼠VDAC1/ROS双阳性细胞数量较MCAO组明显降低(P<0.05)。结论 ROS清除剂EUK-134可以影响线粒体生物发生调节因子PGC-1α和物质运输通道VDAC1的表达,维持线粒体功能,改善脑缺血再灌注损伤。

线粒体活性氧自由基抑制剂R(+) -普拉克索对脑缺血再灌注损伤大鼠JAK2-STAT3通路及炎性因子TNF-α的影响

目的研究线粒体活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)抑制剂R(+)-普拉克索[R(+)-PPX]对大脑中动脉梗塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型大鼠再灌注6 h后内源性酪氨酸激酶2(janus kinase 2,JAK2)-信号转换器和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)信号通路以及炎性因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的影响,探讨R(+)-PPX在再灌注早期保护脑缺血损伤的机制。方法将30只健康雄性SD大鼠依据数字表法随机分为假手术(Sham)组、MCAO组和R(+)-PPX组,每组10只。大鼠MCAO模型制作采用改良线栓法,并于右侧大脑中动脉缺血90 min后拔出线栓进行再灌注。术中监测大鼠肛温,使其维持在正常范围。于再灌注后6 h处死大鼠,迅速取脑,应用Western blotting法检测缺血侧脑组织p-JAK2蛋白水平,免疫荧光染色法检测脑组织冰冻切片缺血半暗带区p-STAT3、TNF-α的表达,采用超氧化物阴离子荧光探针(dihydroethidium,DHE)荧光染色法计数大鼠脑缺血半暗带区ROS阳性细胞数目,应用荧光双标法将ROS分别和p-STAT3、TNF-α在大鼠脑缺血半暗带区进行共定位,应用免疫荧光双标法对p-STAT3和TNF-α共定位。结果1)与Sham组相比,MCAO组大鼠再灌注6 h后,缺血侧脑组织p-JAK2蛋白水平明显升高(P<0.05)。R(+)-PPX组大鼠缺血侧脑组织p-JAK2蛋白水平比MCAO组显著减少(P<0.05)。2)Sham组大鼠脑内未见p-STAT3阳性细胞。MCAO组大鼠再灌注6 h脑缺血半暗带区p-STAT3阳性细胞数比Sham组显著增加(P<0.05)。R(+)-PPX组大鼠缺血半暗带区p-STAT3阳性细胞数比MCAO组显著减少(P<0.05)。且ROS与p-STAT3在大鼠脑缺血半暗带区共定位。3)Sham组大鼠脑内未见TNF-α阳性细胞。MCAO组大鼠再灌注6 h脑缺血半暗带区TNF-α阳性细胞数比Sham组显著增加(P<0.05)。R(+)-PPX组大鼠缺血半暗带区TNF-α阳性细胞数比MCAO组显著减少(P<0.05)。且ROS与TNF-α在大鼠脑缺血半暗带区共定位。4)MCAO组大鼠再灌注6 h脑缺血半暗带区内,p-STAT3与TNF-α免疫荧光染色共定位。结论线粒体ROS抑制剂R(+)-PPX可能通过抑制脑缺血再灌注6 h大鼠缺血脑组织JAK2-STAT3通路激活,降低TNF-α的水平,从而在脑缺血再灌注损伤早期发挥神经保护作用。

常压高浓度氧对脑缺血-再灌注大鼠缺血核心区核转录因子-κB的适度调节作用

目的探究常压高浓度氧治疗(normobaric hyperoxia,NBO)对脑缺血-再灌注大鼠脑内白细胞介素-1β(interleukin 1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、核转录因子(nuclear factor-κB,NF-κB)及其抑制蛋白(inhibitor ofκB,IκB)表达的影响,探讨NBO治疗对脑缺血后NF-κB介导的炎性反应损伤的作用。方法将15只健康雄性SD大鼠(280~320g)依据数字表法随机分为3组:假手术组(Sham,n=3)、正常氧浓度组(Normoxia,n=6)和NBO(n=6)组,应用线栓法制备大鼠大脑中动脉阻塞模型,缺血90 min再灌注24 h。Sham组和Normoxia组大鼠术后呼吸普通空气,NBO组大鼠术后至再灌注前呼吸100%常压氧气。采用免疫荧光染色和Western blotting的检测方法,研究NBO治疗对脑缺血核心区炎性因子IL-1β、TNF-α和转录调节因子NF-κB及其抑制蛋白IκB表达的影响。结果免疫荧光结果显示:(1)与Sham组相比,Normoxia组缺血核心区IL-1β、TNF-α及核移位NF-κB p65阳性细胞数目明显增多(P<0.05),荧光强度增强;(2)与Normoxia组相比,NBO组缺血核心区IL-1β、TNF-α及核移位NF-κB p65阳性细胞数目明显减少(P<0.05),荧光强度减弱。Western blotting结果显示:(1)与Sham组相比,Normoxia组缺血核心区NF-κB p65显著升高,IκB明显降低(P<0.05),(2)与Normoxia组相比,NBO组缺血核心区NF-κB p65水平显著降低,IκB明显升高(P<0.05)。结论 NBO治疗可能通过调节缺血核心区转录调控因子NF-κB的适度活化来抑制脑缺血再灌注炎性损伤,从而实现脑神经保护作用。

脑缺血损伤中锌离子稳态与自噬的相关性

锌离子(Zn2+)既具有神经毒性也具有神经保护作用,这与脑内Zn^(2+)的稳态有关.游离的Zn^(2+)主要通过锌转运蛋白以及锌指蛋白等多种蛋白发挥催化作用,参与调节生物体内包括自噬在内的数百种生理过程.脑缺血损伤可以诱导Zn^(2+)的病理性释放,从而导致神经元过度自噬,最终引起细胞死亡.同样,自噬水平的紊乱也会引起细胞内Zn^(2+)代谢异常.现对脑缺血损伤过程中锌与自噬之间的相互作用及调控关系进行阐述.