老年神经变性疾病蛋白基因研究:3种α-突触核蛋白提取纯化方法的比较

目的:用经济、简便、快捷的方法得到大量、高纯度的α-突触核蛋白。方法:将重组的proEXNACP,pGEXNACPH和pTYBNACP质粒分别转入大肠杆菌DH5α,BL21和ER2566细胞进行培养增菌,IPTG诱导产生α-突触核蛋白;超声破碎、离心粗提取得到融合的α-突触核蛋白;分别经Ni-NTAresin,GlutathioneSepharose4B和ChitinBeads纯化,得到α-突触核蛋白。用SDS-PAGE电泳观察纯度、Western杂交检测正确性、用BCA蛋白定量法测定蛋白含量。结果:3种方法均能得到较高纯度的α-突触核蛋白,其中用Ni-NTAresin提取纯化的α-突触核蛋白的纯度最高;蛋白收获量分别是10mg/L,5mg/L和5mg/L;经济耗费和实验的繁简程度没有较大差异。结论:3种方法均可作为α-突触核蛋白的提取方法。

胚胎干细胞“五步法”体外诱导成为神经细胞的实验观察

目的:采用“五步法”将鼠胚胎干细胞(embryonicstemcell,ES)诱导成为神经元和胶质细胞。方法:首先将ES细胞接种到铺有明胶的培养瓶里,在无滋养层细胞的情况下生长3d,然后将细胞悬浮培养4d成为胚胎体(,胚胎体经过无血清培养基培养6d,富集nestin阳性细胞,在有丝分裂原bFGF作用下扩增6d,最后经过烟酰胺诱导分化6d,共计经过5个步骤。结果:诱导出多量表达Tuj-1的不成熟神经元(约占分化后细胞数量的80%～90%)和表达神经胶质纤维酸性蛋白的星形胶质细胞(5%～10%),还有少量表达微管相关蛋白Ⅱ的成熟神经元(5%～10%)。结论:“五步法”诱导使胚胎干细胞在分化过程中处于不同的阶段,最终诱导出大量不成熟的神经元,少量星型胶质细胞和成熟神经元。为利用不同成熟度的分化细胞移植治疗神经系统疾病提供了充足的细胞来源。

帕金森病睡眠结构改变的研究

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种中老年人常见的神经系统退行性疾病，65岁以上老年人中发病率达1—2％。患者除运动功能障碍外，还存在睡眠障碍、植物神经功能紊乱和嗅觉障碍等非运动障碍症状。其中睡眠障碍存在于至少60％-909／6的PD患者中，严重影响病人的生活质量。因此，帕金森病相关的睡眠障碍日益受到关注。

缺血性脑卒中后抑郁发病率的调查

由于卒中后抑郁加剧卒中对患者的生理和心理上的侵害，影响患者生活质量，导致患者出现种种不良的心境体验和肢体活动障碍，影响患者神经功能和肢体活动功能的康复，使死亡率增加。因此，卒中后抑郁的发生广泛引起人们的关注。研究卒中后抑郁患病的情况和相关因素，对医治和预防都具有重要意义。目的：调查卒中后抑郁的患病率以及相关的因素。方法：对社区2003．1—2005．7发生脑卒中的280名患者（平均年龄为68岁）进行跟踪调查，对患者进行一般情况、卒中次数、卒中部位、神经功能缺损程度、认知功能、日常生活活动能力、是否服用抗抑郁药物等登记。

帕金森病小鼠模型中分子时钟的变化

帕金森病人和帕金森病动物模型中都存在极为显着的节律丧失现象，包括体温变化节律性的丧失，心跳节律性的丧失，排尿节律性的丧失等。虽然在这些节律性丧失已经在生理水平和行为学水平得到反复的证实，但其分子机制仍然没有得到认识。近年来，一系列的节律基因逐步得到发现，包括Per1，Per2，Per3，Bmal1，Clock，Cry1，Cry2等。这些基因在转录和翻译水平相互调节构成网络，从而在分子，细胞，组织和整体水平产生节律。本研究使用MPTP处理C57小鼠，而制备出帕金森病小鼠模型。制模成功5天后，连续24小时，每隔4小时，处死小鼠。取小鼠大脑，纹状体，心脏，肝脏。

帕金森病相关基因重组型14-3-3蛋白与多巴胺代谢

目的:制备并分析帕金森病相关基因重组型14-3-3蛋白对酪氨酸羟化酶活性的影响以及对多巴胺代谢的影响。方法:实验于2004-05/12在首都医科大学宣武医院北京老年医学研究所神经生物学研究室进行。取Balb/c雌性小鼠1只,麻醉下摘取大脑组织并提取总RNA;设计含适当酶切位点的聚合酶链反应引物,采用反转录-聚合酶链反应法从小鼠脑总RNA中分别克隆编码14-3-3γ和14-3-3ε的cDNA,并将其分别亚克隆至谷胱甘肽巯基转移酶融合表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21,以异丙基-D-硫代半乳糖苷诱导,使其表达融合蛋白谷胱甘肽巯基转移酶-1433γ和谷胱甘肽巯基转移酶-1433ε。用凝血酶切断融合蛋白,再用谷胱甘肽-琼脂糖4B亲和层析纯化14-3-3γ和14-3-3ε。将制备的基因重组型14-3-3蛋白添加至酪氨酸羟化酶的反应体系,用高效液相色谱观察酪氨酸羟化酶的活性变化。结果:克隆的两个cDNA片段长度分别为744bp和768bp,编码247和255个氨基酸,与GeneBank中NM-018871和NM-009536展示的cDNA序列编码区结构一致。重组质粒pGEX-1433γ和pGEX-1433ε在原核细胞表达的融合蛋白质量占细菌可溶性蛋白质组分的5%,纯化的14-3-3γ和14-3-3ε在SDS-PAGE上表现为单一条带,表观分子质量分别为30ku和32ku。目的蛋白质不影响酪氨酸羟化酶活性,但使?

人参皂苷Rg1对β淀粉样蛋白诱导细胞凋亡的影响

目的探讨人参皂苷Rg1对β淀粉样蛋白（Aβ）诱导细胞凋亡的影响及其机制。方法利用中国仓鼠卵巢瘤细胞系（CHO）采用MTT方法筛选人参皂苷Rg1抗Aβ细胞毒性的有效浓度。通过转染突变型（M146L）PS1基因的CHO细胞（PS1M146L），利用免疫荧光染色、蛋白质免疫印迹方法，探讨人参皂苷Rg1对PS1M146L细胞中Aβ42和凋亡效应基因半胱氨酸蛋白水解酶（caspase-3）活性蛋白表达的影响，通过脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法和Annexin V—FITC／PI染色流式细胞仪检测，观察人参皂苷Rg1对Aβ促细胞凋亡的影响。结果加用25、50、100μmol／L人参皂苷Rg1的CHO细胞活性明显高于未加用组（均P〈0．05）。在转染突变型PS1M146L的CHO细胞中，加用人参皂苷Rg1作用24h后早期细胞凋亡数（10．11±0．76）较未加用组（15．01±1．46）少，差异有统计学意义（P〈0．05）；同时Aβ42和caspase-3活性片段的蛋白质表达量较未加用组细胞亦不同程度降低（均P〈0．05）。结论人参皂苷Rg1可能通过降低Aβ42生成和降低caspase-3蛋白质表达抑制Aβ诱导的细胞凋亡。