APP17肽对D-半乳糖老化小鼠海马神经元IRS和PI3K表达的影响

目的通过对胰岛素受体底物-1（IRS-1）、胰岛素受体底物-2（IRS-2）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）在海马表达的观察，研究APP17肽对D-半乳糖老化小鼠海马神经元信号转导途径上游步骤的影响。方法小鼠随机分为3组，每组22只：正常对照组（C组）、D-半乳糖模型组（D组）、APP17肽治疗组（D＋P组）。D、D＋P 2组每日皮下注射半乳糖100mg·kg^-1。D＋P组每周一、二、五皮下给药APP17肽0．35μg／只。4个月后，小鼠灌注固定，行脑冰冻切片，用PI3K、IRS-1、IRS-2抗体进行免疫组化染色。Western blot应用IRS—1抗体染色。结果免疫组织化学染色方法检测海马神经元胰岛素受体底物-1、胰岛素受体底物-2、PI3K的表达，结果显示3种抗体C组深染的阳性细胞排列整齐。染色深，突起深染，可见2—3级分支，细胞计数与D组差异有显著性；D组海马阳性反应细胞着色浅，少有突起，细胞数目少，分别为正常对照的67．5％、63．68％和48．6％。APP17肽治疗组（D＋P组）染色结果与C组相似，阳性细胞数目接近C组，与半乳糖老化组比较差异均有显著性，P〈0．05，但阳性细胞突起少于C组，排列亦不如C组整齐。Western blot结果亦显示D组海马表达IRS-1减少，应用17肽后IRS-1表达上调，但不如C组数值高。结论D-半乳糖老化小鼠海马神经元IRS—1、IRS-2、PI3K的表达明显下降；APP17肽能上调D-半乳糖老化小鼠海马IRS—1、IRS-2和PI3K的表达。

大鼠空肠形态学及肠壁交感神经的增龄变化

目的探讨大鼠空肠形态学及肠壁交感神经的随龄变化。方法雄性SD大鼠104只,按不同发育阶段分为6组。光镜观察空肠形态学变化,增殖细胞核抗原(PCNA)、交感神经酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)进行免疫组织化学染色,观察空肠增殖能力及交感神经的变化。结果自1月龄开始大鼠空肠绒毛高度和数量、肠壁肌层厚度逐渐增加,至6月龄达到高峰,而后逐渐降低,24月龄显著降低。不同月龄的大鼠空肠PCNA、交感神经TH也呈现相同变化趋势。结论老化状态下,大鼠空肠形态学发生明显变化,黏膜细胞增殖能力减弱,肌间神经丛交感神经减少,交感神经合成去甲肾上腺素能力下降。

微泵恒速灌注叠氮钠致痴呆大鼠脑内胆碱及单胺类神经递质含量改变

目的观察线粒体呼吸链复合体IV(线粒体细胞色素C氧化酶 )抑制剂叠氮钠对大鼠脑内胆碱及单胺类神经递质的影响 ,探讨线粒体缺陷导致学习记忆障碍的可能机制。方法SD大鼠皮下埋植Alzet微泵 ,连续恒速给予叠氮钠共 3 0天 ,分为 1mg/kg/h和 2mg/kg/h两个剂量组。取脑 ,分区测定皮层和海马胆碱乙酰基转移酶 (放射化学法 )及乙酰胆碱酯酶 (羟胺比色法 )的活性 ;高效液相色谱法测定纹状体内单胺类神经递质及其代谢产物含量。结果模型大鼠皮层和海马胆碱乙酰基转移酶活性降低 ,海马区乙酰胆碱酯酶活性升高 ,皮层和海马胆碱乙酰基转移酶与乙酰胆碱酯酶活性的比值明显降低。纹状体内单胺类神经递质及其代谢产物含量各组间无明显差异。结论线粒体细胞色素C氧化酶活性的抑制可以导致动物脑内胆碱乙酰基转移酶及乙酰胆碱酯酶活性的异常 ,是模型大鼠学习记忆能力障碍的基础。微泵恒速灌注叠氮钠仅损伤大鼠脑内胆碱能神经系统 ,对脑内单胺类神经递质无影响 ,可作为拟痴呆模型 ,应用于发病机理及药理学等方面的研究。

APP17肽对糖尿病大鼠脑枕叶视区皮层神经元退行性变的影响

目的 探讨APP17肽对糖尿病 (DM )大鼠脑内视觉传导通路枕叶视区皮层神经元退行性变的影响。 方法 用链脲佐菌素 (STZ)腹腔注射诱发DM模型 ,10周后取脑组织行免疫组化染色观察神经元内凋亡因子Bax、Bcl 2、CytoC的表达。同时取枕叶视区皮层处脑组织作电镜观察。 结果 DM组枕叶视区皮层 17区内Bax、CytoC阳性反应神经元数目多、染色深 ,Bcl 2较正常组神经元数目少 ,APP17肽组Bax、Bcl 2、CytoC的表达均接近正常组。DM组大鼠枕叶视区皮层神经元超微结构出现明显损害 ,给予APP17肽后病变有改善。

糖尿病早期视网膜靶组织顶盖前区神经退行性病变的观察

目的动态观察糖尿病早期视网膜靶组织顶盖前区神经营养因子和神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,分析其靶组织神经元的改变和神经营养因子的变化与视网膜神经元变性的关系。方法建立糖尿病模型后1周,2周,1月,分别用4%多聚甲醛心脏灌注大鼠,断头取顶盖,冰冻切片,免疫组化检测糖尿病早期视网膜靶组织顶盖前区脑原性神经营养因子(BDNF),神经生长因子(NGF)和GFAP的改变。实验中设正常对照(NC)组。结果与NC组比较,糖尿病1周大鼠顶盖前区BDNF、NGF表达减少;糖尿病2周大鼠顶盖前区胶质细胞和细胞内NGFAP表达增加。结论糖尿病早期视网膜靶组织顶盖前区神经细胞即已出现损害,神经营养因子表达减少,糖尿病早期视网膜靶组织顶盖前区神经退行性病变可能是糖尿病早期视网膜神经元变性的原因之一。

β淀粉样肽前体蛋白N端328—332（APP5肽）类似物神经营养作用的体外实验研究

目的：研究β淀粉样肽前体蛋白N端328—332（APP5肽）类似物对人神经母细胞瘤株SY5Y生长的影响，希望发现可口服的、具有神经营养作用的小分子多肽。方法：合成APP5肽和多个5肽类似物，以SY5Y为细胞模型，以MTT代谢率为筛选指标，并应用胃蛋白酶对APP5肽和类似物165进行消化实验。结果：1．APP5肽及多种类似物均可使MTT代谢率增高，类似物165的效果最好，40μmol／L为最佳有效浓度。2．APP5肽及类似物165可使LDH漏出率减少，细胞数增加，P—CREB、Bcl-2蛋白表达增加。

APP17肽对APP转基因小鼠Aβ相关蛋白表达的影响

目的研究淀粉样前体蛋白(APP)17肽对APP转基因小鼠(APPV717I)海马神经元β淀粉样肽(Aβ)相关蛋白表达的影响。方法将3月龄的APP转基因小鼠随机分为模型组和APP17肽治疗组(隔日皮下注射0.16mg·kg-1,3次/w),并以相同年龄未经转基因处理的C57BL/6J小鼠做正常对照组。8个月后行Morris水迷宫测定,小鼠脑组织灌注固定后进行Aβ1～42、Aβ1～16、APP-N端(52～80)、早老蛋白-1(PS-1)C端、APP的β位点剪切酶(BACE)等蛋白的免疫组化染色。结果模型组小鼠水迷宫实验的逃避潜伏期明显长于APP17肽治疗组和正常对照组(P<0·05),且模型组小鼠海马中Aβ1～42、Aβ1～16、APP-N端(52～80)、PS-1C端、BACE阳性反应神经元明显增加,染色深(P<0·05);APP17肽治疗组与正常对照组相近。结论APP转基因小鼠大脑中存在Aβ相关蛋白的高表达,由此引起记忆、学习能力的改变;而APP17肽能通过抑制β-分泌酶和PS-1的表达而减少Aβ生成,使之接近正常,并能改善小鼠的记忆、学习能力。

复方金思维对阿尔茨海默病大鼠脑组织突触后致密区蛋白95表达的影响与安慰剂及盐酸多奈哌齐干预效果的比较

目的:脑突触后致密区蛋白95具有调节人脑认知活动中突触功能和结构的作用,观察复方金思维干预实验动物致密区蛋白95表达以及学习记忆能力的变化,并与安慰剂及盐酸多奈哌齐干预相对照。方法:实验于2004-11-15/2005-02在北京中医药大学东直门医院药理实验室及首都医科大学宣武医院神经生化室进行。取雄性SD大鼠32只,随机分为4组,每组8只:生理盐水组、模型组、盐酸多奈哌齐组和金思维组。生理盐水组大鼠海马注入2μL生理盐水,其他3组大鼠缓慢注入2μL淀粉样β蛋白1～42(5g/L),复制阿尔茨海默病模型。造模后3d开始给药,盐酸多奈哌齐组按0.92mg/kg的剂量灌胃;复方金思维(由中药人参、肉苁蓉、石菖蒲及郁金等组成)配置成0.36g/mL的浓度,按0.7μL/g的剂量给药;模型组及生理盐水组给3mL的双蒸水,均1次/d,共4周。4周后,以Morris水迷宫测试大鼠学习期间的逃避潜伏期和游泳距离以及记忆测定中的记忆能力,评价行为学变化;以免疫组化检测大鼠海马CA1区、皮质突触后致密区蛋白95表达的变化。结果:经补充后32只大鼠进入结果分析。①Morris水迷宫的学习、记忆测试结果:模型组大鼠逃避潜伏期、游泳距离及记忆能力显著低于生理盐水组(P<0.01),盐酸多奈哌齐组、金思维组大鼠逃避潜伏期、游泳距离及记忆能力较模型组高(P<0.

复方金思维对阿尔茨海默病大鼠脑组织ProSAP/Shank蛋白表达的影响

目的:观察突触后蛋白ProSAP/Shank在模型大鼠脑内表达的变化,探讨复方金思维对阿尔茨海默病大鼠的神经保护作用。方法:实验于2004-11-15/2005-02在北京中医药大学东直门医院药理实验室及首都医科大学宣武医院神经生化室进行。取雄性SD大鼠32只,随机分为4组,每组8只:①生理盐水组:脑海马注入2μL生理盐水,3d后灌胃3mL的双蒸水。②模型组:脑海马缓慢注入2μL淀粉样β蛋白1～42(5g/L),复制拟阿尔茨海默病模型,造模后3d灌胃3mL的双蒸水。③盐酸多奈哌齐组:造模同模型组,造模后3d灌胃盐酸多奈哌齐(0.92mg/kg)。④金思维组:同前造模,造模后3d灌胃复方金思维(由人参、肉苁蓉、石菖蒲、郁金等组成,浓度0.36g/mL,剂量0.7μL/g)。所有给药均1次/d,连续4周。4周后以Morris水迷宫测试大鼠学习期间的逃避潜伏期和游泳距离,记忆测定中的记忆能力,以进行行为学评价。检测大鼠脑海马CA1区、皮质突触后蛋白ProSAP/Shank的变化应用免疫组化方法。结果:经补充后32只大鼠进入结果分析。①Morris水迷宫的学习、记忆测试结果:模型组大鼠逃避潜伏期、游泳距离及记忆能力显著低于生理盐水组(P<0.01),盐酸多奈哌齐组、金思维组大鼠逃避潜伏期、游泳距离及记忆能力较模型组高(P<0.05),盐酸多奈哌齐组和金思维组无差异(P>0.05)。②脑海马CA1区ProSAP/Shank蛋白免疫组化测定结果:模型组平均面密度低于生理盐水组和金思维组(14.35±3.66,21.21±5.66,19.67±3.83,P<0.05),模型组的平均吸光度也低于生理盐水组、盐酸多奈哌齐组和金思维组(68.74±5.98,121.93±8.69,84.36±13.56,84.58±8.24,P<0.01)。③脑皮质区ProSAP/Shank蛋白免疫组化测定结果:模型组的平均吸光度低于生理盐水组和金思维组(84.12±19.40,138.93±28.62,106.53±5.08,P<0.01)。结论:淀粉样β蛋白海马注射可致海马CA1区及皮质Shank蛋白表达下降,说明淀粉样β蛋白聚集损害了海马突触的功能和可塑性。而复方金思维不但显著提高了大鼠的学习、记忆能力,而且使Shank蛋白的表达明显增加,说明它对突触的功能和可塑性具有改善作用。

胰岛素与认知功能

胰岛素是人体胰岛分泌的重要激素,不仅参与能量代谢的调节,对神经细胞还具有营养支持和抗凋亡的作用。胰岛素与中枢的学习和记忆功能密切相关,胰岛素-胰岛素受体信号通路的功能异常、胰岛素抵抗和(或)胰岛素缺乏导致的认知损害可能参与脑老化、Alzheimer病和糖尿病脑病的病理过程。

大鼠空肠胰岛素样生长因子-1信号转导的增龄性变化

目的探讨空肠胰岛素样生长因子-1(IGF-1)信号转导的增龄性变化。方法雄性SD大鼠104只,按不同发育阶段分组。采用免疫组化染色、Western印迹法测定空肠IGF-1、胰岛素受体底物1(IRS-1)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3-K)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化的cAMP反应元件结合蛋白(p-CREB)变化。结果自1月龄开始空肠IGF-1逐渐增加,至6月龄达到高峰,然后逐渐降低,24月龄大鼠空肠IGF-1最低。空肠IRS-1、Akt、p-CREB也出现相同的变化趋势,IRS-1在12、18、24月龄维持于较低的水平,虽然Akt于6月龄表达最强,但仅显著高于24月龄。然而PI3-K则与IGF-1相反,1月龄为最低,其后逐渐升高,至24月龄达高峰。结论随着增龄老年动物空肠IGF-1促细胞生长信号转导显著下调。

P13K特异性抑制剂Wortmannin对APP17肽信号传导通路的影响

目的：利用P13’K的特异性抑制剂Wortmannin阻断SY5Y细胞信号转导通路，观察APP17肽对SY5Y生长的影响，探讨APP17肽的作用机制。方法：体外培养SY5Y细胞，分为对照组、Wortmannin组（3μmol／L）、APP17肽组（30μmol／L）、APP17肽加Wortmannin组、11．5mmol／L葡萄糖组、葡萄糖加APP17肽组、葡萄糖加Wortmannin加APP17肽组，每组8～12孔。观察MTT代谢率、LDH漏出率、细胞轴突长度、胞体面积，进行统计学分析。结果：1．APP17肽可使SYSY细胞MTT代谢率升高、LDH漏出率降低、SYSY细胞轴突长度和胞体面积增加，经Wortmannin作用后，其作用减弱。

AD7C-NTP与胰岛素受体在小鼠海马CA1区的共表达研究

目的：观察AD7C-NTP在正常小鼠海马CA1区的分布及其与胰岛素受体的共存关系。方法：应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白印迹（Westernblot）方法观察小鼠脑蛋白提取物中AD7C-NTP的分子量位置和抗体的特异性；应用免疫组织化学和免疫组织化学双重标记技术观察AD7C-NTP在正常小鼠海马CA1区的分布及其与胰岛素受体的共存关系。结果：AD7C—NTP免疫反应阳性条带位于分子量约41KDa的位置，与文献报道一致；正常小鼠海马CA1区有AD7C_NTP免疫反应阳性细胞分布，细胞膜和细胞浆染色，并存在AD7C—NTP和胰岛素受体免疫反应双阳性细胞。

生长相关蛋白（GAP-43）抗原表位分析及抗体制备

目的：对生长相关蛋白（Growth Associated Proteins-43，GAP-43）进行抗原表位分析并制备兔多克隆抗体。方法：通过对GAP-43基因全长eDNA序列及蛋白质的氨基酸全序列的结构进行生物信息分析，选出具有免疫活性的抗原决定簇多肽片段，采用有机固相多肽合成法合成了GAP-43多肽并与载体蛋白KLH偶联制备成抗原，免疫新西兰家兔；结果：ELISA测定抗体效价1：32000，通过免疫组化方法检测此蛋白在小鼠海马神经元中有阳性表达，

人脑凝集素的研究

脑凝集素是近年从脑中新分离到的一种糖结合蛋白,它可通过盐析和层析的方法加以纯化,已经弄清了这一蛋白的分子结构,其在脑中的分布受生长发育的调节,在不同的发育时期行使其不同的功能,利用免疫学方法可测定血及脑脊液中的含量,并由此可探讨其生理和病理学意义。