反转录巢式多重聚合酶链式反应体系检测单细胞中时钟基因表达

目的建立一种高度灵敏的能够在单细胞水平检测时钟基因表达的反转录巢式多重聚合酶链式反应(multiplex nestedreverse transcription-polymerase chain reaction,multiplex nested RT-PCR)体系。方法选取核心时钟基因bmal1,clock,per1,per2,cry1和cry2,以及看家基因β-actin,分别设计和优化巢式引物对。以基因质粒为模板,检测巢式多重PCR体系的灵敏度。体外转录得到各个基因的RNA模板,并检测反转录巢式多重PCR体系的灵敏度。使用手动微操作器,显微镜下负压获取悬浮单个NIH/3T3细胞,使用反转录巢式多重PCR体系检测其中目的时钟基因。应用实时定量PCR检测整体水平时钟基因表达情况,与单细胞水平进行比较。结果巢式多重PCR检测体系可以检测出单拷贝质粒DNA。反转录巢式多重PCR能够检测出4拷贝RNA模板。利用上述体系发现,NIH/3T3单细胞中时钟基因环路表达存在很大差异,同时发现群体水平per1和per2表达的高峰和低谷间差异有统计学意义,而单细胞水平per1表达则差异无统计学意义。结论建立了高度灵敏的用于检测时钟基因表达的反转录巢式多重PCR体系,揭示了单细胞水平时钟基因表达的异质性,也验证了整体水平与单细胞水平时钟基因表达的差异。

人外周血单个核细胞体外重编程为少突胶质前体细胞研究

目的利用非整合质粒载体在体外将成人外周血中单个核细胞重编程为少突胶质前体细胞(oligodendrocyte progenitor cells,OPCs)。方法经外周静脉采集志愿者血液5 m L,利用Ficoll-Paquem密度梯度离心法获得单个核细胞,体外扩增培养后,电转染携带外源基因(OCT4,SOX2,KLF4,C-myc,LIN28,Nanog)的质粒,然后在加有化学小分子的特定培养基中分三步培养。结果转染后30 d左右,可以获得血小板衍生生长因子受体α(platelet-derived growth factor receptor-α,PDGFR-α)阳性的早期少突胶质前体细胞(Pre-OPC),该细胞能传20代以上,继续分化30 d左右可以获得表达O4的少突胶质前体细胞。结论利用非整合质粒载体携带外源基因可以将成人外周血单个核细胞在较短期时间内重编程为具有增生能力的早期少突胶质前体细胞,且能继续分化为少突胶质前体细胞。

汉族人群雌激素受体β基因多态性与子宫肌瘤的关系

目的研究在中国人汉族人群中,子宫肌瘤的发生与雌激素受体β(estrogen receptor,ERβ)基因多态性之间的关系。方法自2007年1月至2008年6月,采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)来扩增ERβ基因序列,用限制性内切酶对193名平均年龄为(39.64±7.14)岁的健康女性和92名平均年龄为(43.96±6.59)岁的子宫肌瘤患者的ERβ基因扩增产物酶切,测定其基因多态性。结果ERβ的基因多态性AluI在子宫肌瘤组与对照组之间的分布分别为78.3%、19.6%、2.2%以及69.4%、29%、1.6%(P=0.229);RsaI在子宫肌瘤组与对照组之间的分布分别为65.2%、25%、9.8%以及67.4%、28.5%、4.1%(P=0.162),2种基因多态性的分布在2组之间差异均无统计学意义。结论在汉族人群中,ERβ基因的RsaI和AluI多态性分布与子宫肌瘤的发生无相关性。

子宫肌瘤与雌激素受体α基因多态性关系的临床研究

目的研究在中国汉族人群中,子宫肌瘤的发生与雌激素受体α(ERα)基因多态性之间的关系。方法采用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)来扩增ERα基因序列,用限制性内切酶对193名健康女性和92名子宫肌瘤患者的ERα基因扩增产物进行酶切,测定其基因多态性。结果 ER基因XbaI基因型及PvuⅡ基因型在子宫肌瘤组与对照组之间的分布无显著性差异(P=0.862及0.918),XbaI基因型等位基因(x、X)及PvuⅡ基因型等位基因(p、P)的分布两组比较均无显著性差异(P=0.893及0.781)。结论在中国汉族人群中,ERα基因多态性与子宫肌瘤的发生并无相关性。

大鼠脑梗死后48小时移植入胚胎干细胞的存活和分化

目的观察小鼠胚胎干细胞，在大鼠脑梗死发生48h后移植入梗死核心区，是否能够存活并且分化为神经元和胶质细胞。方法小鼠胚胎干细胞去除滋养层后培养，线栓法制作大鼠大脑中动脉堵塞脑梗死模型，成模48h后将胚胎干细胞移植入梗死核心区。移植21d后切片观察。结果植入的胚胎干细胞可在梗死区的边缘存活，并且大量分化成为神经元和胶质细胞，植入细胞所分化出的神经细胞中，表达NeuN和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的神经元和胶质细胞的比例分别达到（83．0±3．2）％和（22．0±3．6）％。结论在脑梗死后48h于核心区植入胚胎干细胞可能成为新的移植方式。

Bmi-1基因RNA干扰对人胚纹状体来源神经干细胞衰老的影响

目的观察原代培养3-4时期的神经干细胞（NSC）经过原癌基因Bmi-1的RNA干扰（RNAi）后是否发生衰老和衰老后的表象，以及Bmi-1下游基因p16INK4n的表达。方法培养流产胎儿皮层来源的NSC。经过Bmi-1基因RNA干扰后，检测其衰老情况和细胞增殖能力的改变，以及其下游基因p16INK4n基因通路的改变。结果体外培养3～4周的NSC增殖旺盛，经过Bmi—1基因RNA干扰，衰老细胞明显增多，表现为衰老染色阳性的细胞数目从（18．57±2．20）％增加到（33．79±7．79）％，但细胞凋亡并无明显增加。与细胞衰老相适应，NSC生长速度变慢，表现为Bmi．1基因RNA干扰1周后神经干细胞的BrdU掺入率（13．2±4．1）％，明显低于空病毒转染组的（23．1±5．5）％。此外，干扰后的NSC细胞中Bmi．1基因的转录明显下调至对照组的约40％，而其下游基因p16INK4a基因明显升高到GFP对照组的10倍以上。结论体外培养的人类纹状体神经干细胞中Bmi-1基因转录水平下降，能够诱发细胞衰老，表现为细胞增殖能力下降。Bmi-1基因下调所引发的衰老可能和p16INK4a基因转录水平升高有关。

神经干细胞的自发永生化

目的 观察培养达24个月的神经干细胞（NSC）是否会发生永生化和恶变.方法 培养流产胎儿皮层来源的NSC.对培养超过24个月的NSC,分析其核型,检测其自我更新、增殖、衰老以及移植后的致瘤性等.检测其Bmi-1-p16INK4a/p14ARF基因通路的改变.结果 体外培养超过24个月的NSC自我更新旺盛,克隆形成率（14.89±4.75）%,显著高于正常培养8周NSC的（8.04±2.07）%;生长速度快,表现为传代1周后的新生神经球的直径为（85.98±30.24）μm,显著高于体外培养8周NSC的（15.97±9.97）μm.此外,培养超过24个月的NSC衰老细胞为（5.96±2.81）%,远低于正常培养8周NSC的（78.14±8.99）%;而且染色体数目异常,这些结果可以确定其发生了永生化.裸鼠移植未发现致瘤性,所以该细胞未发生恶变.此2株细胞中Bmi-1、p16INK4a、p14ARF基因均缺失.结论 体外长期培养的人类皮层神经干细胞能够自发永生化,表现为不进入衰老状态并不断增殖.其增殖不依赖于Bmi-1基因,而其不衰老状态可能和p16INK4a、p14ARF基因缺失有关.

Oct-4在胚胎来源神经前体细胞向神经元分化中的作用

目的应用RNA干扰方法抑制胚胎来源神经前体细胞Oct-4基因表达，以观察Oct-4基因在胚胎来源神经前体细胞向神经元分化中的作用。方法采用“五步法”诱导小鼠胚胎干细胞向神经元分化，进入扩增期后给予Oct-4干扰RNA，采用Real-timePCR方法检测干扰后细胞Oct-4表达情况，进行分化计数，免疫组化鉴定分化后的细胞，计数分化后的新生神经元比例。结果Oct-4干扰RNA使神经前体细胞Oct-4表达下降约40％，正常未干扰胚胎干细胞分化的神经元为（75．5±5．2）％，GFP组为（73．8±4．7）％，Oct4干扰RNA组为（33．8±2．9）％，与正常组和GFP组比较，差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论采用RNA干扰方法可以有效降低神经前体细胞0ct-4的表达，使分化后新生神经元生成减少，证实了Oct-4基因在胚胎来源神经前体细胞向神经元分化中发挥着重要作用。