慢病毒介导GDNF基因对食蟹猴骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

目的探讨慢病毒介导胶质源性神经营养因子(GDNF)对食蟹猴骨髓间充质干细胞(cMSCs)生物学特性的影响。方法无菌条件下取食蟹猴骨髓,梯度密度离心法分离培养cMSCs,以含有GDNF基因的慢病毒感染cMSCs。利用ELISA、Real-time PCR、流式细胞术(FCM)、BrdU掺入法等实验方法,观察慢病毒感染后GDNF基因的表达,以及慢病毒感染前后的cMSCs的表面抗原表达、体外增殖和分化能力。结果感染慢病毒后,体外培养的cMSCs高表达GDNF。慢病毒感染后cMSCs的细胞形态无明显改变,细胞表面标志CD34、CD90和Stro-1阳性细胞比例增高。BrdU掺入结果显示,与对照组(0.61±0.11)比较,GDNF慢病毒感染组(0.50±0.13)明显降低(P<0.05)。但GDNF慢病毒感染并没有影响cMSCs体外脂肪诱导分化能力。结论慢病毒感染影响cMSCs的表面抗原表达和体外增殖能力,但对cMSCs体外脂肪分化能力无影响。

人胚胎骨髓间充质干细胞和单个核细胞静脉移植治疗大鼠脑梗死疗效的比较

目的比较人胚胎骨髓间充质干细胞(MSC)和单个核细胞(MNC)经静脉移植后对脑梗死的疗效。方法采用大脑中动脉远端凝断法制造大鼠脑梗死模型。将大鼠分为假手术组、缺血对照组(造模后经尾静脉给予生理盐水)、MSC组(造模后经尾静脉给予MSC)和MNC组(造模后经尾静脉给予MNC)。移植后2 d,取脑进行梗死体积测定;移植后1、3、5、7 d,采用肢体放置测验和平衡木实验进行行为学评价;移植后7 d,采用免疫荧光法测量梗死周边纹状体区激活的小胶质细胞Iba-1的染色丰度;移植后3、7 d,采用ELISA检测移植后梗死灶周边纹状体区胶质源性神经营养因子(GDNF)和脑源性神经营养因子(BDNF)的蛋白水平。结果缺血对照组、MSC组和MNC组的相对梗死体积分别为(37.85±4.40)%、(33.41±3.82)%和(30.23±3.63)%,其中,MSC组(t=2.100,P=0.034)和MNC组(t=2.109,P=0.0009)显著低于缺血对照组,MNC组显著低于MSC组(t=1.743,P=0.043)。移植后1 d,缺血对照组的肢体放置成功率为(4.32±0.71)%,明显低于假手术组的(9.73±0.36)%(t=2.178,P=8.61×10-11);MSC组和MNC组分别为(5.09±0.62)%(t=2.1009,P=0.024)和(5.90±0.68)%(t=2.1008,P=0.0001),明显高于缺血对照组;MNC组又明显高于MSC组(t=2.1009,P=0.0165)。MSC组和MNC组损伤对侧前肢错步数占总步数的百分比分别为(5.56±0.86)%(t=2.120,P=0.020)和(5.13±0.95)%(t=2.131,P=0.003),明显低于缺血对照组的(6.47±0.61)%。移植后3 d,MNC组的肢体放置成功率为(6.91±1.10)%,明显高于缺血对照组的(5.80±0.82)%(t=2.110,P=0.027);MSC组为(6.30±0.77)%,与缺血对照组差异无统计学意义(t=2.101,P=0.199)。MNC组损伤对侧前肢错步数占总步数的百分比为(4.34±0.58)%,明显低于缺血对照组的(5.31±0.65)%(t=2.100,P=0.006)和MSC组的(4.92±0.53)%(t=2.100,P=0.041),MSC组与缺血对照组差异无统计学意义(t=2.109,P=0.139)。假手术组、缺血对照组、MSC组和MNC组的Iba-1相对丰度分别为1.00+0.00、1.72±0.21、1.23±0.08和1.48±0.06,其中,缺血对照组显著升高,为假手术组的(1.72±0.21)倍(t=2.262,P=2.9×10-6),MSC组则降低至假手术组的(1.23±0.08)倍,比缺血对照组显著降低(t=2.178,P=3.91×10-5),MNC组降低至假手术组的(1.48±0.06)倍,比缺血对照组显著降低(t=2.200,P=0.007),MSC组和MNC组间差异也有统计学意义(t=2.120,P=7.09×10-6)。移植后3 d,MSC组的BDNF和GDNF分别为(531.127±73.176)pg/mg蛋白(t=2.109,P=0.003)和(127.780±16.733)pg/mg蛋白(t=2.100,P=2.76×10-5),均明显高于缺血对照组的(401.988±89.006)pg/mg蛋白和(86.278±14.832)pg/mg;MNC组分别为(627.429±65.646)pg/mg蛋白(t=2.144,P=0.017)和(153.117±20.443)pg/mg蛋白(t=2.144,P=0.017),均明显高于MSC组。移植后7 d,MSC组的BDNF和GDNF分别为(504.776±83.282)pg/mg蛋白(t=2.101,P=0.005)和(81.641±11.019)pg/mg蛋白(t=2.100,P=0.002),均明显高于缺血对照组的(389.257±70.440)pg/mg蛋白和(64.322±9.855)pg/mg;MNC组分别为(589.068±63.323)pg/mg蛋白(t=2.100,P=0.027)和(102.161±19.932)pg/mg蛋白(t=2.144,P=0.017),也均明显高于MSC组。结论脑梗死后1 h静脉移植人骨髓MSC和MNC都能够减小梗死体积、改善动物行为。二者的疗效产生机制可能均与抑制脑内炎症反应,促进脑内神经营养因子的产生有关。MNC减小梗死体积和改善动物行为比MSC更有效,推测可能与MNC诱导脑内产生的细胞因子GDNF和BDNF的量比MSC更高有关。

CM-DiI标记人骨髓间充质干细胞并检测其移植后产生脑源性神经营养因子的实验研究

目的观察荧光染料(CM-Di I)标记人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSC)后,是否会脱落造成周围细胞被污染,标记细胞经静脉移植入脑梗死大鼠后是否会造成宿主脑内神经元被误染色;以及是否可以鉴定人BMMSC产生脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)。方法应用不同浓度CM-Di I分别标记培养的人BMMSC,观察标记效率。将转染绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的人胚肾293T细胞和CM-Di I标记的人BM-MSC细胞共培养,7 d之后观察CM-Di I的红色荧光和293T细胞是否双标记。将CM-Di I标记的人BM-MSC经静脉移植入脑梗死大鼠体内,观察植入细胞的红色荧光是否会沾染宿主细胞以及和BDNF免疫荧光的双标记。结果不同浓度CM-Di I(1 000、200、100、20 nmol/L)均可成功标记人BM-MSC,其中1 000、200 nmol/L浓度标记24 h后观察标记效率均达到98%以上,比100、20 nmol/L标记的效率明显升高(P<0.01)。CM-Di I标记后的人BM-MSC与GFP标记的293T细胞共培养,7 d之内没有发现红色荧光沾染绿色的293T细胞。移植后第3天,静脉植入脑梗死大鼠的标记细胞的红色荧光没有沾染宿主脑内神经元,而且可以和BDNF的绿色荧光形成双标记。结论 CM-Di I可以高效地标记人BM-MSC。采用200 nmol/L浓度标记的人BM-MSC细胞在体外培养和移植入脑梗死大鼠后都未发现对周围细胞造成污染,植入细胞的CM-Di I荧光可以鉴定产生BDNF的人BM-MSC。

人脐带间充质干细胞对帕金森病患者外周血淋巴细胞增生的抑制

目的：观察人脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSC）对男性健康青年人（25～35岁）、健康中年人（50～60岁）、以及中年帕金森病（ Parkinson’ s disease,PD）患者的外周血单核细胞（ peripheral blood mononuclear cell, PBMC）增生的抑制作用,并探讨引发 UC-MSC 发挥抑制作用所需要的细胞因子。方法用不同组合的细胞因子作用后的 UC-MSC 和 PBMC 共培养,观察 PBMC 增生受抑制的情况。结果不仅健康青年人的 PBMC 增生被 UC-MSC 抑制,健康中年人和中年 PD 患者的淋巴细胞也受到抑制,PD 患者 PBMC 受抑制程度比青年人小,但和同年龄组健康中年人相比差异没有统计学意义；UC-MSC 必须经过肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor,TNFα）、白细胞介素-1α（interleukin-1α,IL-1α）、IL-1β中的一种与干扰素-γ（interferon-γ,IFN-γ）联合刺激后才可以发挥抑制作用,“IFN-γ＋IL-1α”和“IFN-γ＋IL-1β”组合刺激 UC-MSC 后对 PBMC 的抑制作用相比“IFN-γ＋TNFα”更强。结论 UC-MSC 对 PBMC 的抑制作用不是自发的,而需要炎性反应因子的刺激,这就提示经过体外炎性反应因子处理的 UC-MSC 可能更适合移植后抗炎性反应治疗的需要；UC-MSC 可以体外抑制 PD 患者 PBMC 增生,至少对于中年患者,帕金森病并没有影响 PBMC 增生对 UC-MSC 抑制作用的反应性,这就为临床实验治疗 PD 提供了一项理论依据。

复制性衰老减弱人胚骨髓间充质干细胞静脉移植治疗大鼠脑梗死的疗效

目的比较不同代次的人胚胎骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs)移植治疗大鼠脑梗死模型的疗效,包括梗死体积和行为学改变以及疗效产生机制,包括对梗死区激活的小胶质细胞的抑制、产生营养性细胞因子上的差别。方法体外培养人胚胎骨髓来源间充质干细胞,并通过连续传代制作复制性衰老模型。分别收集传第4代和第10代的MSC用于移植。制作大鼠大脑中动脉远端阻塞(distal middle cerebral artery occlusion,d MCAO)脑梗死模型。实验分假手术组(无脑梗死)、缺血对照组〔脑梗死模型给予0.9%(质量分数)氯化钠注射液〕和MSC细胞治疗组。移植组在造模后1 h经尾静脉移植1×106不同代次的BM-MSC,移植后2、4 d进行行为学评价;移植后2 d部分动物进行梗死体积测定;部分动物灌注取脑,免疫组织化学法计数并对比皮质梗死区激活的小胶质细胞CD68染色的数量;另一部分动物于移植4 d用ELISA法检测梗死灶区域大鼠来源的脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、胰岛素样生长因子(insulin like growth factor-1,IGF-1)的浓度。结果只有第4代人BM-MSC能够有效减少梗死体积,并在移植后第2天改善脑梗死模型动物的神经功能。移植后第4天,仅第4代BM-MSC移植组脑内BDNF、IGF-1蛋白浓度明显高于缺血对照组,小胶质细胞激活明显低于对照组;第10代MSC对营养性细胞因子和小胶质细胞的影响和缺血对照组相比,差异无统计学意义。结论脑梗死后1 h移植早代次的BM-MSCs会产生减小梗死体积、改善动物行为的作用,但晚代次细胞的作用不明显,原因可能和晚代次细胞促进脑内神经营养因子表达,抑制脑内小胶质细胞激活的能力下降有关。

Bmi-1基因对人类胚胎纹状体来源神经干细胞凋亡的影响

目的探讨Bmi-1基因对人类胚胎纹状体来源神经干细胞（neural stem cell,NSC）凋亡的影响。方法提取16~18周自然流产胚胎脑组织纹状体的NSC,体外培养至3~5代,用慢病毒载体对其进行Bmi-1基因的RNA干扰和过表达回复。观察Bmi-1基因对体外NSC凋亡的影响。结果在感染后2 h和3 d两个时间点,Bmi-1基因的RNA干扰显著增加了体外培养的NSC的凋亡率。结论 Bmi-1基因对于体外培养的NSC具有抑制其凋亡的作用,在分析该基因对NSC增生、自我更新等生物学属性的影响时,应当将Bmi-1基因的抗凋亡作用考虑在内。

将人的皮肤成纤维细胞直接诱导为神经干细胞

目的探讨将人的皮肤成纤维细胞诱导为神经干细胞。方法将成人的皮肤成纤维细胞用带有Pax6报告基因和绿色荧光蛋白的慢病毒感染,并经历其病毒载体的抗性基因嘌呤霉素筛选后的细胞作为初始细胞,转入在维持神经干细胞生长发育、分化、保持功能稳定性和可塑性中起非常重要作用的10个基因Sox2、Klf4、c-Myc、Tcf3、Ascl1、Brn2、Neurog2、Foxg1、Hes1和Id1,对经过重新编程表达GFP绿色荧光蛋白的细胞用流式细胞仪进行筛选,并对其进行免疫荧光染色和分化的鉴定。结果转入基因后成功诱导为神经干细胞(iNSCs)。iNSCs能表达神经干细胞的标志性基因(Nestin),能分化为神经元(βⅢ-tubulin)和星形胶质细胞(GFAP)。结论通过转入外源因子的方式可以将人的皮肤成纤维细胞诱导为神经干细胞。

1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶对食蟹猴嗅球多巴胺能神经元的影响

目的建立食蟹猴1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)帕金森病系统性模型,探讨嗅球中多巴胺(DA)及多巴胺/cAMP调节磷蛋白(DARPP32)的表达情况。方法 3只成年健康食蟹猴,静脉注射MPTP,建立帕金森病系统性模型,取出嗅球,切片,免疫组织化学染色DA和DARPP32,摄片并观察DA和DARPP32在食蟹猴嗅球中的分布及表达情况,采用Image Pro-Plus软件,半定量分析模型组和正常组之间DA和DARPP32的表达差异。结果食蟹猴嗅球中DA和DARPP32神经元集中分布于突触小球层,DA神经纤维分布于突触小球层,而DARPP32神经纤维分布于嗅球各层,以突触小球层(GL)和外网状层(EPL)最为密集。MPTP损伤后,与正常对照组比较,DA和DARPP32神经元及神经纤维均减少,以DA神经元及神经纤维减少明显。结论食蟹猴嗅球中DA神经元和神经纤维分布于突触小球层。食蟹猴MPTP帕金森病系统性模型的嗅球DA能神经元和纤维明显减少,可能与帕金森病嗅觉障碍有关。

胎儿骨髓MSCs中Bmi-1和p16基因表达与其复制老化的关系

目的:探讨胎儿骨髓间充质干细胞(MSCs)中Bmi-1和p16基因表达随传代次数增加的变化情况,阐明其与MSCs复制老化之间的关系。方法:取孕16、17和25周流产胎儿的股骨,利用贴壁培养法分离、培养、扩增骨髓MSCs。采用流式细胞术检测第5代MSCs中CD13、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105、CD133和HLA-DR的表达;连续传代30代,诱导培养MSCs老化;用BrdU掺入率检测第5(P5)、15(P15)和30代(P30)骨髓MSCs的增殖能力;采用Real-time PCR法检测上述细胞中Bmi-1和p16基因mRNA的表达量。结果:从孕16、17和25周的流产胎儿股骨骨髓中均能分离、培养、扩增出MSCs,均表达CD13、CD44、CD73、CD90和CD105,不表达CD34、CD45、CD133和HLA-DR;随着MSCs的不断传代,细胞生长速度逐渐减慢,细胞变成扁平状,折光性下降。P5与P15MSCs的BrdU掺入率比较差异无统计学意义(P>0.05),P30与P5和P15MSCs的BrdU掺入率比较均明显降低(P<0.05)。P5MSCs中Bmi-1mRNA表达水平高于P15和P30MSCs(P<0.05),P15MSCs中Bmi-1mRNA表达水平高于P30MSCs(P<0.05)。P5与P15 MSCs中p16mRNA表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05),但P30 MSCs中p16mRNA表达水平明显低于P5和P15MSCs(P<0.05)。结论:胎儿股骨骨髓能培养出MSCs,其复制老化与Bmi-1的表达有关联,但其信号通路可能不通过p16INK4a-Rb介导。

菲立磁标记食蟹猴骨髓间充质干细胞的脑内移植示踪研究

中枢神经系统损伤后的再生修复问题一直是神经科学领域关注的重点之一,骨髓间充质干细胞移植治疗拓宽了人类中枢神经系统损伤的治疗前景,而非侵入性的磁共振成像能活体追踪移植细胞,评价移植效果。应用菲立磁标记食蟹猴骨髓来源的间充质干细胞,在脑立体定位仪引导下,自体脑内移植。结果显示,菲立磁标记间充质干细胞的有效率高达90%以上,移植区磁共振影像呈明显的低信号改变。标记的间充质干细胞移植后在脑内存活,并向周围的脑实质内迁移。移植8周后,发现移植细胞通过血管向对侧脑部迁移,但并未发现移植细胞向神经细胞分化。这些结果提示,菲立磁可用于标记、追踪脑内移植的食蟹猴骨髓间充质干细胞,标记的移植细胞可在脑内存活、迁移。

胚胎来源hBM—MSCs对大鼠外周血单个核细胞及脑梗死区TNF-a的免疫抑制作用研究

目的观察胚胎来源人骨髓间充质干细胞（hBM-MSCs）能否抑制体外培养的大鼠外周血单个核细胞（PBMCs）增殖和炎症因子表达，探讨哪些人源性促炎因子可以诱导hBM-MSCs发挥免疫抑制作用，并观察hBM-MSCs对脑梗死模型大鼠梗死区肿瘤坏死因子-α（TNF-α）mRNA和蛋白表达的影响。方法将提取的hBM-MSCs和大鼠PBMCs进行共培养，并以在培养基中添加10 μg/mL刀豆蛋白A（ConA）方式激活大鼠PBMCs。（1）实验主要包括hBM-MSCs＋PBMCs组、hBM-MSCs＋PBMCs＋ConA组、PBMCs组、hBM-MSCs组，采用CCK-8法检测各组细胞增殖情况。（2）实验主要包括hBM-MSCs＋PBMCs＋ConA组、PBMCs＋ConA组，采用ELISA法检测培养液中TNF-α、干扰素-γ （IFN-γ）、白介素-10 （IL-10）的表达水平。（3）实验分为hBM-MSCs＋PBMCs （IFN-γ＋IL-1α）组、hBM-MSCs＋PBMCs （IFN-γ＋IL-1β）组、hBM-MSCs＋PBMCs （IFN-γ＋TNF-α）组、hBM-MSCs＋PBMCs组，采用CCK-8法检测各组细胞增殖情况。（4）SD大鼠30只按随机数字表法分为假手术组、对照组（脑缺血后尾静脉给予生理盐水）和hBM-MSCs组（脑缺血后尾静脉给予hBM-MSCs），每组10只。术后3 d取材，采用RT-PCR、Western blotting检测脑梗死区TNF-α mRNA和蛋白表达。结果（1）与PBMCs组、hBM-MSCs组相比，hBM-MSCs＋PBMCs组吸光度值均显著升高，差异均有统计学意义（P〈0.05）。与hBM-MSCs＋PBMCs组相比，hBM-MSCs＋PBMCs＋ ConA组吸光度值明显下降，差异有统计学意义（P〈0.05）。（2）与PBMCs＋ConA组TNF-α、IFN-γ[（1030± 196） pg/mL、（2880±250） pg/mL]比较，hBM-MSCs＋PBMCs＋ConA组TNF-α、IFN-γ表达[（160±10） pg/mL、（240±55） pg/mL]明显降低，IL-10表达[（330±45） pg/mL vs. （750±110） pg/mL]明显升高，差异均有统计学意义（P〈0.05）。（3）hBM-MSCs＋PBMCs （IFN-γ＋IL-1α）组、hBM-MSCs＋PBMCs（IFN-γ＋ IL-1β）组、hBM-MSCs＋PBMCs （IFN-γ＋TNF-α）组吸光度值与hBM-MSCs＋PBMCs组比较均明显下降，差异均有统计学意义（P〈 0.05）。（4）对照组TNF-α mRNA相对表达量（2.369±0.788）较假手术组（0.490±0.128）显著升高，hBM-MSCs组（1.002±0.408）较对照组显著下降，差异均有统计学意义（P〈 0.05）。对照组、hBM-MSCs组TNF-α蛋白相对表达量（0.314±0.029、0.240±0.029）较假手术组（0.144± 0.028）显著升高，hBM-MSCs组较对照组显著下降，差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论hBM-MSCs异种移植可以抑制大鼠体内外炎症反应，但该抑制作用需要炎症因子的刺激；hBM-MSCs静脉植入脑梗死模型大鼠取得的治疗作用与其免疫抑制能力有关。

食蟹猴胚胎干细胞向间充质前体细胞诱导分化及鉴定

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)可以诱导分化成脂肪、软骨、骨骼和骨骼肌细胞,并可作为骨骼、软骨或肌肉移植中的再生干细胞,广泛应用于细胞治疗和组织工程。胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)具有体外培养无限增殖和多向分化的特性,能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。该研究通过无血清条件下诱导食蟹猴ESCs形成类胚体(embryoid bodies,EBs),然后在血清条件下贴壁分化EBs成间充质前体细胞(mesenchymal precursor cells,MPCs),再经过长期体外培养,纯化和扩增MPCs。结果显示,纯化后的MPCs具有MSCs生物学特征,并能在体外诱导分化成脂肪细胞和骨细胞。将这些细胞皮下注射给SCID小鼠,并未发现形成肿瘤,提示食蟹猴ESCs来源的MPCs具有一定的安全性。

GDNF慢病毒载体感染食蟹猴骨髓间充质干细胞

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是基因工程和细胞治疗的种子细胞之一,本研究利用含胶质源性神经营养因子(glial cell derived neurotrophic factor,GDNF)基因的慢病毒载体感染成年食蟹猴MSCs,探讨转染后GDNF在MSCs中的体外表达水平及其影响因素。首先,通过密度梯度离心法分离食蟹猴骨髓单核细胞(marrow mononuclear cells,MNCs),体外培养食蟹猴MSCs。同时构建表达GDNF的慢病毒载体,并感染食蟹猴MSCs,分别利用酶联免疫吸附(ELISA)方法和Real-time PCR方法,测定感染不同拷贝数病毒和不同转染组细胞GDNF的蛋白分泌水平和基因表达水平。实验结果显示,表达GDNF基因的慢病毒载体成功转染成年食蟹MSCs,体外培养的MSCs持续表达分泌GDNF。感染慢病毒的拷贝数可以影响GDNF分泌水平,相同条件下感染拷贝数越高,GDNF分泌量越多,其基因表达水平越高。

同种异体骨髓间充质干细胞静脉移植治疗脑梗死大鼠的疗效和机制研究

目的探讨同种异体骨髓间充质干细胞（BM—MSCs）静脉移植治疗脑梗死大鼠的疗效及作用机制。方法90只SPF级SD雄性大鼠随机分为假手术组、对照组和MSC移植组，每组30只。采用大脑中动脉远端阻塞法（dMCA0）制备大鼠脑梗死模型，造模后1h经尾静脉移植MSC，移植后24h、48h行行为学评价，缺血后48h灌注取脑后测定梗死体积，用免疫组织化学法计数梗死周边皮层小胶质细胞数，并用ELISA法检测梗死灶周边皮层IGF-1,bFGF蛋白水平。结果移植后MSC移植组的脑梗死体积较对照组小，且行为学测试得分较对照组改善（P〈0．05）；梗死灶周边皮层小胶质细胞激活与对照组的差异无统计学意义（P〉0．05）；梗死周边皮层IGF-1,bFGF蛋白较对照组升高（P〈0．05）。结论BM—MSCs静脉移植可改善脑梗死大鼠的行为学表现，其机制可能与增加脑内营养性细胞因子有关。

脑梗死大鼠早期静脉移植BM-MSCs可诱导皮层梗死区表达BDNF的Iba-1+小胶质细胞显著增加

目的探讨脑梗死大鼠早期静脉移植同种异体骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)后皮层梗死区表达脑源性神经营养因子(BDNF)的主要细胞类型及BM-MSCs移植对其数量和比例的影响。方法(1)实验一:将15只SD大鼠按随机数字表法分为假手术1组、梗死对照1组、BM-MSCs移植1组,每组5只。后2组制备成远端大脑中动脉闭塞模型,BM-MSCs移植1组于造模后1 h经尾静脉注射1×106个细胞标记试剂CM-DiI(红色荧光)标记的BM-MSCs。各组大鼠于造模后48 h灌注取脑,采用免疫荧光染色检测皮层梗死区BDNF和CM-DiI标记的BM-MSCs的双标阳性染色情况。(2)实验二:将15只SD大鼠按随机数字表法分为假手术2组、梗死对照2组、BM-MSCs移植2组,每组5只。后2组制备成远端大脑中动脉闭塞模型,BM-MSCs移植2组于造模后1 h经尾静脉注射1×106个未标记的BM-MSCs。各组大鼠于造模后48 h灌注取脑,采用免疫荧光染色检测皮层梗死区BDNF和离子钙适配分子1(Iba-1)+、CD68+小胶质细胞及神经元特异核蛋白(NeuN)+神经元的双标阳性染色情况。结果(1)BM-MSCs移植1组大鼠脑内可见红色荧光标记的BM-MSCs,散在分布于皮层梗死区及梗死周边区,其中皮层梗死区中约有9.70%±3.47%的BM-MSCs表达BDNF,占所有BDNF+细胞的13.32%±4.48%。(2)BM-MSCs移植2组大鼠脑内皮层梗死区中,38.40%±9.04%的BDNF+细胞为Iba-1+小胶质细胞,11.65%±2.76%的BDNF+细胞为CD68+小胶质细胞,28.96%±6.99%的BDNF+细胞为NeuN+神经元。BM-MSCs移植2组皮层梗死区BDNF+/Iba-1+小胶质细胞数量[(92.06±36.52)个/mm2]及其占全部Iba-1+小胶质细胞的比例(79.21%±12.27%)均明显高于梗死对照2组[(31.13±10.23)个/mm2、60.15%±28.20%],差异均有统计学意义(P<0.05)。结论脑梗死大鼠早期静脉移植的同种异体BM-MSCs可迁移至脑内并在皮层梗死区表达BDNF,且该区域表达BDNF的其他细胞类型主要为神经元和小胶质细胞。BM-MSCs移植可促进分泌BDNF的Iba-1+小胶质细胞的数量和比例显著增加,这可能是其疗效产生的机制之一。

骨髓间充质干细胞静脉移植治疗大鼠脑梗死的机制研究

目的观察炎性因子和营养因子在静脉植入同种异体骨髓间充质干细胞（MSC）治疗大鼠脑梗死中的作用。方法采用大脑中动脉远端阻塞法（dMCAO）制作大鼠脑梗死模型，假手术组开颅但不凝断血管、移植组于造模后1h经尾静脉移植1×106大鼠骨髓MSC，缺血对照组注射等量生理盐水。移植后48h取脑用ELISA法检测皮层梗死核心区及纹状体促炎因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-6，抗炎因子IL-4、IL-10，以及营养因子IGF-1、GDNF、BDNF的含量。结果同种异体骨髓MSC移植后48h，和缺血对照组比较，移植组脑梗死区炎性因子IFN-γ、IL-6显著降低，TNF-α、IL-1β显著升高，纹状体区IL-10显著下降。移植组梗死区BDNF的含量比缺血对照组显著增高，纹状体区IGF-1的含量也比缺血对照组显著升高；GDNF在各组间无显著差异。结论脑梗死后1h同种异体静脉移植骨髓MSC治疗dMCAO模型，其梗死后48h时间点的治疗效果和MSC抑制炎性反应没有明确联系，而更可能和大鼠脑内营养性细胞因子增加有关。