老年神经变性疾病机制研究的基础:人α-突触核蛋白基因在原核细胞中的蛋白表达

目的:为提供人α-突触核蛋白(α-synuclein)抗原,制备抗体以研究其自身聚集在老年神经变性疾病病理机制中所起作用,重组质粒载体、进行DNA测序,以用于α-突触核蛋白基因在原核细胞中的蛋白表达。方法:将质粒pcDNA3NACP(pcDNA3α-synucleincDNA)和质粒载体proEXMTHT1分别进行酶切,取α-突触核蛋白cDNA片段,重组于proEXMTHT1质粒载体上;酶切鉴定后测序;再将重组质粒proEXNACP转染进入DH5α大肠杆菌体内;用IPTG诱导α-突触核蛋白基因产生蛋白;将α突触核蛋白纯化后行Western杂交。结果:质粒proEXMTHT1和pcDNA3NACP经限制性内切酶消化分别得到4750bp和550bpDNA片段。α-突触核蛋白基因在原核细胞中蛋白表达量为10mg/L。表达蛋白经Western杂交证实为a-突触核蛋白。结论:α-突触核蛋白基因在原核细胞的蛋白表达可作为体内外研究老年神经变性疾病病理机制的基础研究。

微管蛋白和微管作用物质研究及其在神经退行性疾病中的机制探讨

背景:tau蛋白是一种微管相关蛋白。研究表明,变异的tau蛋白被认为是阿尔茨海默病患者产生老年斑的关键;人突触核蛋白(Syn)是参与形成帕金森病患者淀粉样变性的主要成分。目的:总结近年来微管相关作用物质的研究进展及其与神经退行性疾病的相关性。方法:以"tubulin;Alzheimer Disease;Parkinson Disease;Neurodegeneration:微管蛋白;神经退行性疾病;阿尔茨海默病;帕金森病"为检索词,检索1975年3月至2014年3月Pub Med数据库及万方医学网相关文献。纳入微管结构与功能、微管与神经退行性疾病相关蛋白、微管蛋白相关物质及其与神经退行性疾病相关研究的文献26篇进行分析探讨。结果与结论:微管由微管蛋白组成,在细胞中起重要的细胞骨架作用。在神经系统,微管系统的稳定性也是维持胞体和突起间营养转运的基础。已证实微管蛋白与帕金森病、阿尔茨海默病等神经退行性疾病的关键蛋白密切相关。tau蛋白异常聚积导致的轴突转运障碍不仅影响神经元的形态,而且影响其功能。Syn可以促进生长初期原代培养神经元轴突内微管的组装。当细胞受到不良刺激时,发生微管相关物质的不良代谢,导致微管系统产生结构的紊乱和功能的障碍,胞内物质异常堆积,并通过一系列目前尚待阐明的调控机制使细胞逃逸凋亡,从而进入退行性变性。目前的神经退行性疾病的临床治疗也多以替代法治疗为主,尚无特效药物。

突变型α-突触核蛋白对大鼠原代培养神经元突起生长作用研究

目的观察人α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)和其突变体A30P和A53T对大鼠原代培养神经元突起生长的影响,明确α-Syn的生理功能,揭示突变体A30P和A53T在帕金森病的发病机制中的作用。方法取大鼠大脑皮质神经元分组培养,在细胞外添加A30P、A53T和α-Syn,培养1 h、2 h和4 h后固定,比较A30P、A53T与α-Syn对神经元突起生长的影响。神经元突起以成像显微镜观察测量,Western blotting法、免疫荧光法、单克隆抗体阻断实验鉴定各蛋白作用的特异性。结果添加α-Syn组的神经元培养至1、2和4 h时,其突起的平均长度大于对照组和添加A30P、A53T组(P<0.05)。A30P、A53T组和对照组的神经元突起长度差异无统计学意义(P>0.05)。增加蛋白的含量,浓度越高,α-Syn组神经元突起的平均长度与添加A30P和A53T组差异越大(P<0.01)。Western blotting和免疫荧光实验明确了外源性α-Syn可以从培养基进入到神经元内,并均匀分布在胞体和突起。而A30P和A53T组,并未发现。结论α-Syn在原代神经元生长初期对其突起生长具有促进作用,突变体A30P和A53T,无促神经元突起生长作用,这一现象可能与其在帕金森病发病机制中的作用有关。

α-突触核蛋白寡聚体对多巴胺能神经细胞线粒体膜电位的影响

目的体外制备α-突触核蛋白寡聚体，研究其对多巴胺能神经细胞线粒体膜电位的影响。方法于磷酸盐缓冲液中振荡孵育重组人α-突触核蛋白，应用Western blotting和双抗体夹心酶联免疫吸附测定方法观察α-突触核蛋白寡聚体的形成规律；免疫荧光双重标记法检测α-突触核蛋白单体和寡聚体向经体外培养的MES23．5多巴胺能神经细胞内及线粒体的转运及分布情况：罗丹明法测定α-突触核蛋白寡聚体对线粒体膜电位的影响。结果 α-突触核蛋白在磷酸盐缓冲液中振荡孵育可以形成多种形式的寡聚体（包括二聚体、三聚体、四聚体和十四聚体），形成数量随着振荡孵育时间的延长及α-突触核蛋白单体浓度的升高而增加（均P〈0．01）。甜突触核蛋白单体和寡聚体可以进入MES23．5多巴胺能神经细胞并进一步转运至线粒体上，二者均可不同程度地降低线粒体膜电位，与空白对照组相比差异有统计学意义（均P=0．000）；α-突触核蛋白寡聚体对线粒体膜电位的降低作用较其单体更为明显，二者比较差异有统计学意义（P=0．000）。结论α-突触核蛋白在适当的体外振荡孵育条件下可以形成不同形式的寡聚体，寡聚体进入多巴胺能神经细胞后可明显降低线粒体膜电位。

α-突触核蛋白促进大鼠原代培养神经元突起生长

目的研究人α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)对神经元突起生长的作用。方法原代培养新生大鼠大脑皮质神经元,细胞外添加α-Syn蛋白,测定不同时间神经元突起的长度;观察添加不同浓度的α-Syn蛋白后神经元突起的生长情况。结果α-Syn处理组神经元突起的平均长度在培养1h、2h和4h时均明显大于对照组,α-Syn的这一作用可被其特异性单克隆抗体阻断;向培养基中添加不同浓度的α-Syn后,神经元突起的长度随α-Syn浓度的增加而增加。结论α-Syn具有促进神经元突起生长的作用,并且呈明显的量-效关系。

α-突触核蛋白功能片段向多巴胺能神经细胞内的转运及其对细胞增殖的影响

目的研究α-突触核蛋白(α-Syn)3个功能片段的促多巴胺能神经细胞增殖作用并且观察其亚细胞分布。方法原核表达重组人野生型α-Syn及其3个功能片段:N-末端、NAC片段和C-末端。向MES 23.5多巴胺能神经细胞的培养基中添加α-Syn及其3个功能片段,观察α-Syn全长及其3个功能片段对细胞的增殖的影响的生长曲线,用细胞免疫荧光检测α-Syn及其功能片段向细胞内的进入和分布。结果α-Syn全长及其NAC片段和C-末端均可促进细胞的增殖,但其N-末端片段对细胞增殖无影响。α-Syn及其3个功能片段均可以进入MES23.5多巴胺能神经细胞,3个功能片段在细胞内的亚细胞分布不同:α-Syn全长分子分布于胞质和胞核,但胞核中的含量多于胞质;N-末端片段主要分布于胞质和突起;NAC片段分布于胞质;C-末端片段主要分布于细胞核中。结论α-Syn对细胞增殖的促进作用与其NAC片段以及C-末端片段的氨基酸排列顺序有关。α-Syn及其功能片段均可进入多巴胺能神经细胞内,但其亚细胞分布不同。

低氧预适应上调大鼠海马神经元和星形胶质细胞在急性缺氧时的葡萄糖转运蛋白的活性和基因表达

目的研究低氧预适应对海马神经元和星形胶质细胞在急性缺氧暴露时的葡萄糖转运蛋白的活性和基因表达的影响。方法培养大鼠海马神经元和星形胶质细胞,每天间歇暴露于低氧混合气体(1%O2、10%CO2、89%N2)20 m in,连续6 d。最后1次低氧暴露24 h后,将细胞暴露于无氧混合气体(10%CO2、90%N2)6 h,然后立即检测[3H]-2-脱氧葡萄糖(2-DG)的摄取率、GLUT1和GLUT3的mRNA水平及神经元的存活率。结果低氧预适应上调急性缺氧时神经元和星形胶质细胞的2-DG吸收率、星形胶质细胞GLUT1mRNA的表达及神经元GLUT1和GLUT3mRNA的表达,提高神经元存活率,这一作用可被细胞松弛素B消除。结论低氧预适应上调海马神经元和星形胶质细胞在急性缺氧时的葡萄糖摄取率和葡萄糖转运蛋白的基因表达。

α-突触核蛋白在大鼠脑神经元中的亚细胞定位

目的研究α-突触核蛋白(α-SYN)在大鼠脑神经元的亚细胞分布。方法利用2种新的识别不同表位的抗α-SYN单克隆抗体2E3和3D5,应用免疫组织化学、免疫荧光标记和Western blot分析法对α-SYN在大鼠脑神经元的分布进行观察。结果2E3单抗检测到α-SYN主要存在于神经元的突触前终末;3D5单抗除了能够检测到突触前终末的α-SYN外,还可以检测到α-SYN在神经细胞核的大量存在。Western blot分析表明,2种抗体在胞质和核组分中均可以检测到一个19 ku的蛋白,与α-SYN的表观分子质量一致。结论α-SYN免疫活性物质不仅存在于脑神经元的突触前神经末梢,而且也存在于核中,但识别不同表位的抗体对不同亚细胞部位的α-SYN的结合能力不同。

突变型α突触核蛋白对大鼠皮质神经元原代培养存活率的影响

目的观察α-突触核蛋白(α-Syn)和其家族性突变型A30P和A53T对大鼠皮质神经元原代培养存活率的影响。方法取大鼠前脑皮质神经元进行分组培养。在培养基中添加α-Syn和其突变体A30P、A53T,培养至1 h、2 h和4 h进行观察,比较A30P、A53T与α-Syn对原代培养神经元生长的影响。神经元以成像显微镜观察并计数,Western印迹法、免疫荧光法、单克隆抗体阻断实验鉴定各蛋白作用的特异性。结果添加α-Syn组的神经元培养至1 h、2 h和4 h时,其神经元的平均存活率大于对照组和添加A30P、A53T组(P<0.05)。A30P组和A53T组的神经元存平均活率与对照组无差异(P>0.05)。增加蛋白的浓度,α-Syn组神经元存活率与添加A30P和A53T组差异越大(P<0.01)。western blot和免疫荧光实验证实α-Syn可由培养基进入到神经元内,而A30P和A53T不能进入神经元。结论α-Syn在大鼠皮质原代神经元培养初期对其存活率具有促进作用,而其突变体A30P和A53T无这一作用,这一现象与其发生家族性突变有关,并可能成为导致PD发病原因之一。

共聚物-1致敏T淋巴细胞保护MPTP帕金森病模型小鼠黑质多巴胺能神经元

目的明确C57BL/6J小鼠MPTP模型保护黑质多巴胺(dopamine,DA)神经元的共聚物-1(Copolymer-1,Cop-1)致敏淋巴细胞的类型。方法将80只雄性C57BL/6J小鼠分为Cop-1/BSA致敏淋巴细胞移植组、Cop-1/BSA致敏T淋巴细胞移植组、去T淋巴细胞Cop-1/BSA致敏淋巴细胞移植组、MPTP模型组和正常对照组,每组10只。C57BL/6J小鼠1d内接受4次MPTP(18mg.kg-1)腹膜腔注射,每次注射间隔2h,正常对照组动物仅接受等量的0.9%氯化钠注射液注射。MPTP末次注射后,除MPTP模型组和正常对照组动物外,其他组动物立即分别接受不同的Cop-1/BSA致敏淋巴细胞移植。细胞移植7d后处死动物,取脑。酪氨酸羟化酶免疫组化及体视学方法定量分析黑质DA神经元数。结果黑质DA神经元定量分析显示,MPTP注射使模型对照组黑质DA神经元减少到正常对照组的37.68%,BSA致敏淋巴细胞移植组(38.15%)、BSA致敏T淋巴细胞移植组(41.44%)和去T淋巴细胞的Cop-1/BSA致敏淋巴细胞移植组结果(Cop-1:40.06%,BSA:34.81%)和模型对照组类似。而Cop-1致敏淋巴细胞移植和Cop-1致敏T淋巴细胞移植组黑质DA神经元数为正常对照组的74.38%和84.64%,DA神经元数明显高于模型对照组、BSA致敏淋巴细胞移植组和去除T淋巴细胞的BSA/Cop-1致敏淋巴细胞移植组(P<0.01)。结论在MPTPC57BL/6J小鼠模型,Cop-1致敏T淋巴细胞可有效对抗MPTP毒性,保护黑质DA神经元。

α-突触核蛋白功能片段对原代培养大鼠神经元突起的促生长作用

目的:研究人α-突触核蛋白(α-Syn)对原代培养大鼠神经元突起的促生长作用,阐明该蛋白质的功能片段,并探讨其作用机制。方法:获取新生Wistar大鼠大脑皮层神经元分组培养,分别加入α-Syn(添加α-Syn组)、α-Syn功能片段N端(添加N端组)、C端(添加C端组)和NAC段(添加NAC段组),对照组不添加功能片段。倒置相差显微镜观察各组神经元突起的长度,Western blotting法、免疫荧光法特异性鉴定各组α-Syn蛋白的表达水平。结果:在生长至1和2h,添加C端组和α-Syn组的神经元突起平均长度长于对照组(P<0.05),而添加NAC段组和N端组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);生长至4h,添加α-Syn组和C端组的神经元突起平均长度明显长于对照组(P<0.01),而添加NAC段组和N端组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Western blotting和免疫荧光法检测,N端和C端可以进入神经元,NAC段不能进入神经元。结论:α-Syn在原代神经元生长初期对其突起生长具有促进作用,具有这一功能的片段位于C端,其机制可能是其通过胞膜进入到神经元内,促进微管蛋白聚合形成微管,加速细胞骨架的形成和轴浆转运。

α-突触核蛋白功能片段对大鼠原代培养神经元的促生长作用

目的研究α-突触核蛋白(α-Syn)对Wistar大鼠原代培养神经元的促生长作用。方法培养新生24 h的Wistar大鼠大脑皮质神经元,以一定密度接种至培养皿中。设计分组,在各组别培养基中加入α-Syn和它的功能片段NAC段、N端和C端。培养至1、2、4 h固定观察,计数存活神经元的数目。Western印迹法、免疫荧光法进行特异性鉴定。结果当原代神经元培养至第1、2小时,α-Syn组和C端组的神经元数目比对照组多(P<0.05),N端组和NAC段组与对照组无差异(P>0.05);培养至第4小时,α-Syn组和C端组的存活神经元数目比对照组明显增多(P<0.01),而N端组和NAC段组与对照组无差异(P>0.05)。增加C端浓度,可以提高神经元的存活率(P<0.05)。Western印迹法和免疫荧光法证实蛋白质片段N端和C端可由培养基进入到原代神经元中,而NAC片段不能进入神经元。结论α-Syn在原代神经元培养初期对其生长有促进作用,具有这一功能的蛋白片段为C端,其可能的机制是进入到神经元内,促进胞内代谢活动,从而利于神经元的生长。

α-突触核蛋白对大鼠原代培养神经元突起的促生长作用

α-突触核蛋白（α-Synuclein，α-Syn）是在神经系统中表达丰富的蛋白质，存在于神经元的突触前终末、轴突、胞体和细胞核中。α-Syn的突变和异常表达与帕金森病的发病机制密切相关，但该蛋白有何生理功能尚不十分清楚。体外研究提示，α-Syn可以促进-tubulin组装成微管。鉴于微管是神经元突起形成的重要细胞骨架，

缺血性卒中患者血浆葡萄糖脑苷脂酶和蛋白磷酸酶2A及神经酰胺水平的变化

目的分析缺血性卒中患者血浆葡萄糖脑苷脂酶(GBA)、蛋白磷酸酶2A(PP2A)及其降解产物神经酰胺的改变。方法回顾性纳入2013年5月至9月武警后勤学院附属医院神经内科急性缺血性卒中住院患者45例,另收集同期年龄和性别相匹配的45名体检中心的健康者为对照组。采集患者和健康受试者静脉血,抗凝分离血浆。采用蛋白质芯片H50和激光解析电离飞行时间质谱方法测试血浆神经酰胺水平。结果缺血性卒中患者血浆GBA和PP2A水平均明显低于对照组,缺血性卒中组和对照组的GBA水平分别为(2.4±0.8)、(13.1±1.4)U/L,差异有统计学意义(P<0.05),而PP2A水平分别为(6.5±2.8)、(14.5±4.7)U/L(P<0.01)。缺血性卒中患者血浆神经酰胺相对量为1.9±0.7,明显低于对照组的12.2±5.0(P<0.01)。结论缺血性卒中患者血浆GBA和PP2A以及神经酰胺水平均降低,提示卒中患者血液中α-突触核蛋白的异常磷酸化。

急性重复低氧对小鼠脑组织血氧饱和度、线粒体功能以及ATP水平的影响

目的:探讨急性重复低氧对脑组织血氧饱和度与线粒体功能的影响。方法:将BALB/c小鼠置于低氧密闭罐中,通过小鼠呼吸消耗罐内氧造成罐内低氧,以小鼠出现喘呼吸为低氧耐受极限,然后将小鼠转到另一低氧密闭罐中,依此类推,连续进行5次低氧。记录小鼠每次的缺氧耐受时间、局部脑组织血氧饱和度,测定每次低氧暴露结束时的脑组织的线粒体复合体I活性和ATP含量。结果:小鼠的缺氧耐受时间随缺氧暴露次数增加而显著延长。脑组织血氧饱和度在第1、2次缺氧暴露时急剧下降,但在第3、4、5低氧暴露时先小幅度下降再逐渐恢复至正常水平,然后再缓慢降低。脑组织线粒体复合体I的活性随着缺氧次数的增加逐渐被抑制,ATP含量在第1次低氧暴露结束时低于正常水平,在第3、5次低氧暴露结束时高于正常水平。结论:急性重复低氧导致脑组织血氧饱和度降低的速度减慢、线粒体功能抑制以及脑组织ATP水平增高,后者很可能是动物脑组织耐缺氧能力增强的重要机制。

重复急性低氧对小鼠大脑皮质中α-突触核蛋白表达的影响

利用本研究室制备的抗α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-SYN)单克隆抗体作为研究工具,在一种低氧预适应小鼠模型上研究了重复急性低氧对大脑皮层中α-SYN表达的影响。Western blot分析结果表明,小鼠在经过重复急性低氧刺激后,皮层脑组织内α-SYN蛋白含量呈现规律性的变化,表现为第一次急性低氧后明显增加,而经过重复低氧第4次后则回落,接近正常水平;免疫组化染色结果显示,α-SYN免疫阳性物质除存在于神经元的末梢外,还存在于某些神经元的核中。分析大脑皮质细胞核呈α-SYN免疫阳性的神经元的密度发现,核呈α-SYN阳性的神经元密度也在第一次急性低氧后明显增加,而经过重复低氧第4次后回落。以上结果提示,重复急性低氧能够改变α-SYN在脑内的表达水平以及α-SYN核阳性神经元的数量。这种变化的机制和生理意义有待于进一步探讨。

帕金森病患者血清低分子量蛋白质差异表达分析

目的探讨帕金森病(Parkinson’s disease,PD)患者区别于正常人的血清蛋白质差异表达。方法选择原发性PD患者35例和正常人35例,用弱阳离子交换(weak cationic exchange,WCX)磁珠捕获血清蛋白质组分,用MALDI-TOF-MS(matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometer)检测各样品的蛋白质质谱,统计学筛选差异表达分子,监督神经网络算法建立区分模型,盲法验证。结果在PD组和对照组之间筛查到8个差异分子(非参数检验Z值范围为-4.458～-3.059,P<0.05)。以监督神经网络算法建立区分模型,其判断正确率为81.4%。对25例新样本的盲法验证结果显示,模型的正确率为76.0%。结论PD患者血清蛋白质的表达谱有别于正常人。蛋白质组学数据结合生物信息学方法可能有助于PD的诊断。

急性重复低氧对小鼠脑组织中糖酵解和线粒体氧化磷酸化以及能量负荷的影响

目的探讨小鼠在重复急性低氧暴露后脑组织中的糖酵解、线粒体氧化磷酸化及能量负荷的变化。方法成年BALB/c小鼠重复低氧暴露5次,测定每次低氧暴露时的平均耐受时间、体温及第0、1、3、5次低氧暴露后脑组织中的磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)、线粒体复合体Ⅰ活性和磷酸腺苷水平。结果重复低氧暴露使小鼠低氧耐受性增强,体温降低,脑组织中PFK和PK活性先增高后降低,复合体Ⅰ活性持续降低,能量负荷保持稳定。结论重复急性低氧使小鼠脑组织的糖酵解活性出现规律性变化,线粒体的氧化磷酸化受抑制,但能量负荷保持稳定。

利用荧光定量聚合酶链反应检测小鼠纹状体中Per1基因的表达规律

目的建立定量检测Per1 mRNA表达水平的系统,并检测小鼠纹状体中该基因的表达规律。方法提取小鼠纹状体总RNA,用Per1基因特异性引物进行聚合酶链反应(PCR),以荧光染料SYBR green I法进行实时检测。结果确定了Per1基因荧光定量的扩增和检测参数。证明在此条件下无非特异扩增,并且扩增效率在90%以上。利用此检测体系发现小鼠纹状体内Per1基因的表达呈节律性波动。结论所建立的方法能够定量测定Per1 mRNA表达水平,具有灵敏度高,线性范围广的特点。纹状体中Per1基因表达的节律性波动提示黑质纹状体系统间的相互调节可能具有昼夜节律性差异。

缺血/再灌注大鼠脑和血浆中α-突触核蛋白含量的变化

目的探讨缺血/再灌注大鼠脑和血浆中α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)含量的变化。方法将30只雄性Wistar大鼠用随机数字表法分成假手术对照组(10只)和缺血/再灌注组(20只)。用线栓法制作大脑中动脉梗阻(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,缺血1.5h后,再恢复灌注24h;用Western blotting法和ELISA法检测大脑缺血半暗带、梗死核心区和血浆中α-Syn的含量变化。结果缺血半暗带α-Syn表达量显著增加,而梗死核心区和血浆中α-Syn无显著性变化。结论缺血/再灌注可增加缺血半暗带中α-Syn的含量。