转化生长因子-β1通过产生活性氧诱导骨髓间充质干细胞分化为肌成纤维细胞

目的：研究转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）诱导骨髓间充质干细胞（bone marrowderived mesenchymal stem cells,BMSCs）向肌成纤维细胞分化的机制。方法：采用全骨髓贴壁培养法体外培养小鼠原代BMSCs,将对数生长期的P3∽P5代BMSCs作为实验细胞,使用不同浓度的TGF-β1诱导BMSCs向肌成纤维细胞分化,并在此基础上观察加入自由基清除剂N-乙酰-半胱氨酸（N-acetylcysteine,NAC）对其分化的影响。采用实时荧光定量PCR及Western blot技术检测BMSCs分化指标α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）、Ⅰ型胶原[collagenα1（Ⅰ）,Colα1（Ⅰ）]和Ⅲ型胶原[collagenα1（Ⅲ）,Colα1（Ⅲ）]的表达情况。使用2’,7’-dichlorohydrofluorescein diacetate（DCFH-DA）预孵育BMSCs 15 min,然后加入TGF-β1处理不同时间,检测TGF-β1刺激下BMSCs中活性氧（reactive oxygen species,ROS）的产生,并使用高内涵方法对BMSCs中产生的ROS进行统计分析。结果：TGF-β1可以剂量依赖地诱导BMSCs向肌成纤维细胞分化,上调α-SMA、Colα1（Ⅰ）和Colα1（Ⅲ）的表达。TGF-β1诱导BMSCs分化的作用可以被NAC阻断。TGF-β1在BMSCs中能够引起ROS的产生,且该过程迅速而短暂,当TGF-β1作用30 min时,其在BMSCs中诱发的ROS达到峰值。结论：TGF-β1通过产生ROS介导BMSCs向肌成纤维细胞分化。

一种简单的分离、培养及鉴定小鼠外周血单核巨噬细胞方法的建立

目的在L929条件培养基的作用下体外分离、培养小鼠外周血单核巨噬细胞,并进行鉴定。方法密度梯度离心法分离小鼠外周血单核巨噬细胞,用L929条件培养基培养7 d。采用免疫荧光的方法检测F4/80的表达以及细胞的吞噬作用,用流式细胞术进一步检测细胞吞噬率。结果用L929条件培养基诱导培养7 d后小鼠外周血单核细胞表达F4/80,加入细胞吞噬珠之后,在不同时间点用荧光显微镜可以看到红色荧光颗粒聚集在小鼠外周血单核巨噬细胞核周围,用流式细胞仪检测细胞的吞噬率为24.8%±0.79%。结论该方法是一种简单、易操作的体外分离培养和鉴定小鼠外周血单核巨噬细胞的方法。

GFER抑制四氯化碳对HepG2细胞的损伤

目的探讨HepG2细胞内生长因子ERV1样基因(growth factor Erv1-gene,GFER)表达降低后对四氯化碳(CCl4)诱导的细胞损伤的影响,以进一步明确GFER对于肝细胞的保护作用。方法首先将GFER siRNA转染入HepG2细胞,72 h后收集细胞并通过Western Blot检测GFER的表达以明确沉默效率。再次将GFER siRNA转染入HepG2细胞72 h后,用CCl4处理细胞6 h和24 h,检测细胞内ATP的含量,caspase-3的活性,并应用MTS方法测定细胞的增殖能力以及TUNEL方法检测细胞凋亡。结果 Western blot结果显示转染GFER siRNA后细胞内GFER的表达降低。CCl4处理细胞6 h后,GFER表达降低使细胞的增殖能力下降,细胞内ATP含量增加,细胞凋亡更为明显。CCl4处理24 h后,GFER表达降低使细胞的增殖能力进一步下降,Caspase 3活性进一步升高,凋亡细胞数目显著增多,而ATP的含量明显下降。结论 GFER表达降低促进CCl4对HepG2细胞的损伤。

磷酸鞘胺醇受体在四氯化碳引起的肝纤维化小鼠肝脏的表达

目的研究四氯化碳(CCl4)引起的肝纤维化小鼠肝组织中的磷酸鞘胺醇(sphingosine 1-phosphate,S1P)受体1、2、3(S1P1-3)mRNA和蛋白含量的变化。方法制备小鼠CCl4肝纤维化模型,采用实时荧光定量聚合酶链反应方法测定小鼠肝组织S1P1-3mRNA表达情况;采用免疫印记(Western blotting)方法测定小鼠肝组织S1P1-3蛋白表达情况。结果CCl4诱导小鼠肝纤维化2周或4周后,与对照组相比,小鼠肝组织的S1P1mRNA的表达差异无统计学意义,而S1P2、S1P3mRNA的表达显著上调(P<0.05);与之相对应,S1P1的蛋白表达差异无统计学意义,而S1P2、S1P3的蛋白表达明显增加(P<0.05)。结论在CCl4引起的小鼠肝纤维化形成过程中,S1P、S1P在mRNA和蛋白水平均显著上调,表明S1P相关受体在肝纤维化发生过程中起重要作用。

肝刺激因子对非酒精性脂肪性肝炎保护作用的初探

目的通过油酸(oleic acid,OA)诱导人肝癌细胞系BEL-7402建立非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)的细胞模型,探讨肝刺激因子(hepatic stimulator substance,HSS)对NASH的保护作用。方法采用25、50、100、200、400μmol/L浓度OA处理BEL-7402细胞24h后,再采用噻唑蓝[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT]法检测OA对细胞存活率的影响,使用脂质检测试剂盒测定细胞中三酰甘油(triglyceride,TG)的含量,以最适实验条件作用于转染空载体和稳定转染HSS的BEL-7402细胞,检测细胞内TG的含量及细胞上清中丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)含量,油红O染色观察细胞内脂质堆积情况以及使用caspase-3/7活性测定试剂盒检测细胞凋亡情况,综合观察稳定转染HSS保护肝细胞免受损伤的能力。结果用200和400μmol/L浓度的OA作用于BEL-7402细胞24h可以使细胞活力显著降低。OA浓度为100μmol/L时,BEL-7402细胞内的TG含量最多。与转染空载体的细胞相比,稳定转染HSS细胞内的TG含量和胞外ALT含量均显著下降,用油红O染色可以观察到细胞内红色脂滴沉积减少。结论 HSS对OA诱导的NASH肝损伤起保护作用。

CKIP-1对非酒精性脂肪性肝病小鼠肝细胞凋亡的影响

目的观察酪蛋白激酶2相互作用蛋白-1(CKIP-1)对非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)小鼠肝细胞凋亡的影响并探讨其相关机制。方法实验研究。使用油酸(OA)制备NAFLD细胞模型。将Flag-CKIP-1表达载体以及shRNA-CKIP-1转染肝细胞, 实现CKIP-1的异常表达。采用流式细胞术检测肝细胞凋亡水平。Western blot检测凋亡相关蛋白表达。构建CKIP-1敲除NAFLD小鼠模型, 肝脏病理切片免疫组化检测凋亡相关信号蛋白表达。结果 CKIP-1转染后, 肝细胞脂肪变性的程度明显减轻。与OA组相比, OA+sh-CKIP-1组肝细胞凋亡率明显增加(P<0.01), 而OA+CKIP-1组肝细胞凋亡率明显下降(P<0.05)。CKIP-1抑制NAFLD细胞模型中凋亡相关信号分子蛋白caspase-3和caspase-9的表达(P<0.05、P<0.01), 同时增加Bcl-2/Bax的表达水平(P<0.05)。CKIP-1敲除增加NAFLD小鼠肝细胞凋亡相关信号caspase-3和caspase-9的表达(P<0.01, P<0.05), 同时降低Bcl-2/Bax的表达(P<0.05)。结论 CKIP-1通过上调Bcl-2/Bax凋亡开关, 产生对蛋白酶caspase-3和caspase-9的影响, 从而抑制肝细胞的凋亡, 改善NAFLD细胞的脂肪变性程度。

硫氧还蛋白-1(Trx1)氧化还原状态的检测

硫氧还蛋白-1(thioredoxin-1,Trx1)是一种广泛存在于生物体内的氧化还原调节蛋白,其氧化还原状态的变化是细胞内发挥氧化还原调控作用的重要过程.本文建立了Trx1氧化还原状态的检测方法—氧化还原蛋白免疫印迹法(redox Western blot),即通过碘乙酸(IAA)标记Trx1,根据蛋白所带负电荷的不同,达到分离蛋白氧化与还原状态的目的,并根据能斯特方程计算出相应的氧化还原电势.本方法是在蛋白免疫印迹(Western blot)的基础上建立的,具有低成本、易操作的特点.实验中分别采用H2O2和DTT处理样本,利用此方法检测了细胞裂解液中、细胞内及过表达Trx1氧化还原电势的变化;并检测了HEK293细胞不同生长时期Trx1的氧化还原状态.

脂多糖通过TLR4参与小鼠脂肪性肝损伤模型炎症反应观察

目的:研究在小鼠脂肪性肝损伤中脂多糖(LPS)参与肝脏炎症反应的机制。方法:动物实验采用30只雄性ICR小鼠,随机分为对照组、造模第3天组、造模第7天组、造模第14天组、造模第28天组,每组6只。对照组饲喂正常饲料,4个造模组饲喂蛋氨酸胆碱缺乏联合高脂饲料建立小鼠脂肪性肝损伤模型。造模后取肝脏采用ELISA法检测LPS含量; qRT-PCR法检测Toll样受体4 (TLR4) mRNA的表达;免疫荧光染色观察TLR4蛋白的分布。细胞实验采用从小鼠骨髓分离培养的单核/巨噬细胞,分为对照组和LPS组,分别用PBS或LPS刺激6 h后采用qRT-PCR法检测单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、诱导型一氧化氮合酶(i NOS)、巨噬细胞炎症蛋白-1β(MIP-1β)、白细胞介素-6(IL-6) mRNA的表达; ELISA法检测细胞培养上清中MCP-1蛋白的含量。结果:5组小鼠肝组织中LPS含量比较,差异无统计学意义(P=0. 313);与对照组比较,造模第14、28天组肝组织中TLR4 mRNA表达增加(P <0. 05); TLR4蛋白在造模第14天小鼠肝脏的非实质细胞中表达。与对照组比较,LPS组MCP-1、TNF-α、IL-1β、iNOS、MIP-1β、IL-6 mRNA和MCP-1蛋白表达增加(P <0. 05)。结论:LPS在小鼠脂肪性肝损伤中通过上调单核/巨噬细胞炎症因子的表达发挥促炎作用。

非酒精性脂肪性肝炎及肝纤维化动物模型的建立

目的通过胆碱缺乏饮食及乙硫氨酸的联合作用构建非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)及肝纤维化动物模型。方法选择雄性C57BL/6J小鼠给予含60%高脂的胆碱缺乏饲料,并在第1周的饮水中辅以0.165%的乙硫氨酸加重打击。于第4周、第8周和第16周各随机处死5只小鼠。分离血清,取肝脏组织分别进行HE染色、油红O染色及天狼猩红染色,应用图像分析法对天狼猩红染色结果进行胶原含量半定量分析。结果造模第4周,血清中ALT、AST及TG的含量明显上升,油红O染色显示肝脏组织已经出现大量的脂滴堆积,HE染色可见大量空泡,但无病理性纤维化发生。造模第8周,肝脏组织除可见大量脂滴,天狼猩红染色观察肝组织中央静脉及汇管区周围胶原纤维少量增生。造模第16周,天狼猩红染色在窦周隙内可见成细丝状乃至索状的胶原纤维分布。结论经改良方法后,成功建立小鼠NASH及肝纤维化的模型。

线粒体损伤在非酒精性脂肪性肝病发生发展中的作用

线粒体是重要的细胞器,调节细胞脂质代谢、氧化磷酸化和ATP合成。线粒体生物合成障碍、稳态失衡乃至结构破坏都将导致脂质代谢紊乱以及氧化应激。非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是肝细胞脂质堆积为特征的慢性肝病。NAFLD是一个进展性疾病,表现为肝细胞脂肪变、脂肪性肝炎、肝纤维化和肝硬化这一轴向过程。目前认为线粒体在NAFLD发病中发挥着重要作用,NAFLD也被称为“线粒体病”。综述了脂质代谢障碍、氧化应激、线粒体稳态失衡等线粒体损伤与NAFLD发生发展的相关性。

硫氧还蛋白-1对代谢型谷氨酸受体1a毒性的抑制作用

目的研究在HEK293细胞中过表达代谢型谷氨酸受体1a(Metabotropic gluatamate receptor 1,mGluR1a),引起激动剂非依赖型细胞死亡的分子机制和硫氧还蛋白-1(Trx1)在此过程中的作用。方法采用噻唑蓝法、DCF法、免疫印迹法以及氧化还原蛋白印迹法分别检测了Trx1对细胞活力,细胞内活性氧(ROS)含量,AKT等信号通路的影响,以及Trx1本身氧化还原状态的改变。结果 HEK293细胞中过表达mGluR1a,发现ROS生成量增多,磷酸化AKT减少,PARP剪切量增多,Bcl-2表达量减少以及细胞活力降低。共转染Trx1后,可逆转上述现象。同时发现Trx1、mGluR1a之间不存在相互作用。结论在HEK293细胞中,Trx1通过清除过表达mGluR1a产生的ROS,调节相关的信号通路,从而调控过表达mG luR1a导致的细胞毒性造成的细胞死亡。本文揭示了Trx1,mGluR1a与ROS之间的一种新调节关系,以及这种关系在调控细胞生长和死亡过程中的重要意义。