表达金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的高靶向、双调控溶瘤腺病毒载体的构建、鉴定及其抗膀胱肿瘤作用

目的构建表达超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的高靶向、双调控选择增殖型溶瘤腺病毒SG502-SEA及对照组携带超抗原SEA基因的非增殖溶瘤腺病毒DC318-SEA，并探讨其潜在的抗膀胱肿瘤作用。方法将超抗原SEA基因片段经SpeI和SalI双酶切后，克隆入经同样酶切后的非增殖溶瘤腺病毒载体pSG218中，将鉴定正确的腺病毒载体命名为pDC318-SEA。同样方法将超抗原SEA基因片段克隆入双调控特异性增殖溶瘤腺病毒载体pSG502中，将鉴定正确的腺病毒载体命名为pSG502-SEA。将以上两种携带SEA基因的病毒载体与病毒骨架质粒PPE3-ccdB共转染293细胞，9—14d出现病毒空斑，经过3次病毒空斑纯化，提取腺病毒DNA，应用PCR进行鉴定，经鉴定正确的腺病毒分别命名为DC318-SEA和SG502-SEA。大量扩增后，氯化铯梯度离心纯化腺病毒，测病毒滴度。结果经PCR及酶切鉴定，SEA基因成功克隆到两病毒载体中，可以表达SEA基因，且病毒滴度为2．5×10^10pfu／ml。结论成功构建表达超抗原SEA基因的双调控、高靶向选择增殖型溶瘤腺病毒SG502-SEA及对照组携带超抗原SEA基因的非增殖溶瘤腺病毒DC318-SEA。

装载超抗原SEA基因的由前列腺特异性抗原和端粒酶逆转录酶启动子双调控靶向前列腺癌的溶瘤腺病毒载体的构建

目的构建表达超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素（SEA）基因的由前列腺特异性抗原（PSA）启动子及端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子双调控的特异性增殖溶瘤腺病毒SG504-SEA。方法从前列腺癌组织基因组DNA中获得522bp大小的PSA启动子序列，将PSA启动子克隆到由hTERT启动子调控的特异性增殖溶瘤腺病毒载体SG502中，得到靶向前列腺癌细胞的双调控溶瘤腺病毒载体SG504。将已构建好的含有771bp大小SEA基因片段的病毒骨架质粒PPE3-ccdb—SEA与SGSIM用Lipofectamine 2000共转染至293细胞。共转染后9—14d出现病毒空斑，经过3次病毒空斑纯化，经鉴定正确的腺病毒命名为SG504-SEA，即携带SEA基因的双调控靶向前列腺癌的特异性溶瘤腺病毒。结果经聚合酶链反应（PCR）及酶切鉴定，SEA基因成功克隆到病毒载体中，可以表达SEA基因，且病毒滴度为2．0×10^10pfu／ml。结论成功构建表达超抗原SEA基因的双调控选择增殖型溶瘤腺病毒SG504-SEA。

单抗偶联靶向超抗原SEA对人膀胱癌细胞株BIU-87的抑制作用及其机制

目的 研究单抗偶联靶向超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A（SEA）对人膀胱癌细胞株BIU-87的抑癌作用.方法 实验分对照组、SEA组及单抗靶向SEA组;以外周血单个核细胞为效应细胞,BIU-87为靶细胞,以不同效靶比接种细胞;对照组予全培养液,后2组分别予不同稀释浓度的SEA及单抗靶向SEA,以细胞计数kit-8（CCK-8）测定各组BIU-87细胞的增殖抑制率;荧光染色法观察凋亡形态学变化;流式细胞术检测凋亡率,Western印迹检测Bax、Bcl-2蛋白的表达;酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定共培养上清白细胞介素（IL）2、肿瘤坏死因子（TNF）α、γ干扰素（IFN-γ）含量.结果 单抗靶向SEA组细胞增殖抑制率为[（31.2±2.6）%～（88.7±3.0）%],显著高于对照组[（5.8±3.0）%～（16.5±4.0）%]及SEA组[（20.7±2.1）%～（68.6±4.0）%]（P＜0.05）.实验组细胞均发生典型的凋亡形态学改变,其中单抗靶向SEA组凋亡率为[（14.6±0.7）%～（66.5±3.3）%],显著高于SEA组[（9.1±0.6）%～（29.9±1.3）%]及对照组[（4.6±0.7）%～（6.5±0.3）%]（P＜0.05）.实验组较对照组均有上调Bax/Bcl-2比值作用,其中单抗靶向SEA组为（3.29±0.34）,显著高于SEA组（1.21±0.05）及对照组（0.45±0.15）（P＜0.05）.单抗靶向SEA组12、24 h共培养上清中的IL-2、TNF-α、IFN-γ浓度与SEA组比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）.结论 单抗靶向SEA对膀胱肿瘤细胞显示出更强大的增殖抑制作用,这可能与其进一步上凋肿瘤细胞Bax/Bcl-2比值促进其凋亡有关.