APE1在肝癌中的差异表达及其对肝癌细胞增殖、凋亡的影响

目的探究脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(apurinic-apyrimidinic endonuclease 1,APE1)在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)组织和细胞中的差异表达及其对肝癌细胞增殖、凋亡的影响。方法免疫组化检测80例肝癌及对应癌旁组织芯片中APE1表达量;同时,Western blot检测人肝癌细胞BEL-7402、BEL-7405、HCC-9204、Hep3B、HepG2、SMMC-7721、Huh-7及正常肝细胞L-02中APE1表达量。统计并分析APE1表达与肝癌临床病理特征的关系。针对Hep3B肝癌细胞,构建APE1shRNA载体,并检测干扰效率。MTT法检测细胞增殖活性,AnnexinⅤ-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡。结果 APE1在肝癌组织和细胞中表达均显著升高,其表达在不同TNM分期、组织病理分级间存在显著差异。建立稳定转染APE1shRNA的细胞株,并发现APE1表达的降低可显著降低Hep3B细胞增殖活性,提高细胞凋亡率。结论 APE1沉默表现出了较强的抗肿瘤潜能,具有一定的临床意义,为将来基于APE1进行肝癌临床诊断、预后判断及分子靶向治疗提供了新的思路和理论依据。

APE-1对肝癌细胞裸鼠成瘤能力及PKM2表达的影响及机制探索

目的探索脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶-1(APE-1)对肝癌细胞裸鼠成瘤能力及丙酮酸激酶M2(PKM2)表达的影响及机制。方法基于沉默APE-1表达的肝癌Hep3B稳定细胞株,进行BALB/c-Nude裸鼠皮下成瘤。APE-1沉默组接种APE-1沉默表达的细胞,对照组接种转染空白质粒的细胞,每组10只裸鼠。8周后处死裸鼠,计算成瘤率,完整剥离肿瘤组织,称瘤体重量并计算肿瘤体积。免疫组化及Westernblot法检测肿瘤组织中APE-1及细胞增殖标志性蛋白增殖细胞核抗原(PCNA)、核KI-67抗原(Ki-67)表达。同样方法检测PKM2蛋白表达后,基于TCGA数据库中374例肝癌患者数据,分析APE-1与PKM2表达相关性,并比较PKM2不同表达肝癌患者中生存曲线差异。结果2组裸鼠成瘤率均为100%,APE-1沉默组的肿瘤重量及体积均小于对照组(P<0.05)。APE-1沉默组肿瘤组织中APE-1、PC-NA、Ki-67和PKM2蛋白表达均低于对照组(P<0.05)。APE-1和PKM2表达线性正相关(P<0.001),且PKM2在肝癌患者中高表达组和低表达组整体生存曲线分布比较差异有统计学意义(P<0.001),低表达组生存期更长。结论APE-1可能通过影响PKM2抑制肝癌细胞裸鼠成瘤能力,具有较强的抗肿瘤潜能。

APE-1 shRNA与过表达载体的构建及其对肝细胞免疫炎性因子、细胞凋亡的影响

目的探究脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(apurinic-apyrimidinic endonuclease 1,APE-1)小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)与过表达载体构建及对肝细胞免疫炎性因子表达、细胞凋亡的影响。方法基于基因表达数据库GEO获取肝移植免疫耐受患者及非耐受患者外周血基因表达谱数据,通过R语言程序分析差异表达基因,获得肝移植免疫耐受相关基因APE-1。构建4个平行APE-1 shRNA载体(APE-1 shRNA_1,APE-1 shRNA_2,APE-1 shRNA_3,APE-1 shRNA_4),经质粒测序、Real-time PCR检测mRNA表达、Western blot检测蛋白表达筛选沉默效果最优的APE-1 shRNA。同理构建并鉴定APE-1过表达载体。STRING网站预测APE-1蛋白互作网络。利用构建的APE-1 shRNA和过表达载体,干预人正常肝细胞L-02的APE-1表达(分为对照组、APE-1沉默组和APE-1过表达组),ELISA法检测各组细胞炎性因子IL-1β、IL-10、TNF-α、INF-γ的表达情况,流式细胞术检测各组细胞凋亡变化。结果筛选获得35个肝移植免疫耐受相关显著差异表达基因,选取肝移植免疫耐受患者高表达基因APE-1。获得沉默效果最优APE-1 shRNA_1载体及APE-1过表达载体。预测APE-1与ANP32A、FEN1、HMGB2、LIG1、MUTYH、NTHL1、OGG1、PCNA、POLB、SET等蛋白具有潜在相互作用。APE-1沉默导致L-02细胞(APE-1沉默组)炎性因子IL-1β、IL-10、TNF-α、INF-γ表达显著升高,细胞凋亡率显著增加;相反,APE-1过表达后(APE-1过表达组)L-02细胞炎性因子表达显著降低,细胞凋亡率显著降低。结论 APE-1表达可影响人正常肝细胞株L-02细胞炎性因子表达及细胞凋亡,这可能是肝移植免疫耐受中的关键基因。