应用抑制性消减杂交技术筛选XTP3的反式激活基因

目的 应用抑制性消减杂交技术构建乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP3的差异表达的cDNA消减文库 ,克隆XTP3反式激活相关基因。方法 以XTP3表达质粒pcDNA3 1(- ) XTP3转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1(- )为对照 ;制备转染后的细胞裂解液 ,提取mRNA并逆转录为cDNA ,经RsaⅠ酶切后 ,将实验组cDNA分成两组 ,分别与两种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR ,将产物与T/A载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 文库扩增后得到 30个白色克隆 ,经菌落PCR分析 ,得到 2 3个 2 0 0～ 10 0 0bp插入片段。对所得片段测序 ,并进行同源性分析 ,共得到 2 0种已知基因序列和 2种未知功能基因序列 ,可能是XTP3反式激活靶基因。结论 成功构建了乙型肝炎病毒XTP3反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定了基础。