Lipidoid作为新型脂质载体对肝脏非实质细胞的靶向作用实验研究

目的探讨新型脂质载体Lipidoid对肝脏的细胞靶向效率,为抗肝纤维化治疗提供一定实验室依据。方法C57BL/6小鼠分别给予CCl_4灌胃建立肝纤维化模型,同时给予Lipidoid、Lipidoid/siRNA-TIMP-1尾静脉注射,通过Masson染色观察各组小鼠肝脏纤维化情况,并通过实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹检测Lipidoid/siRNA-TIMP-1对TIMP-1表达水平的影响;通过对小鼠尾静脉注射绿色荧光(GFP)标记的Lipidoid-GFP,取其肝组织进行冰冻切片分别进行Desmin及F4/80染色,评价Lipidoid-GFP对肝脏非实质细胞的靶向作用;通过对小鼠分离的原代肝星状细胞SW-HSC、小鼠巨噬细胞系(RAW264.7)转染Lipidoid-GFP,流式细胞仪分别检测上述两种细胞中GFP荧光强度。结果通过对肝组织进行Masson染色发现,在CCl_4诱导的肝纤维化小鼠模型中,给予Lipidoid/siRNA-TIMP-1治疗可显著降低胶原纤维的沉积;实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹结果显示Lipidoid/siRNA-TIMP-1可以显著抑制TIMP-1基因的表达;肝组织冰冻切片Desmin及F4/80染色结果显示,Lipidoid-GFP主要被肝脏肝星状细胞和Kuffer所捕获,肝星状细胞、Kuffer细胞捕获Lipidoid-GFP的阳性率分别为13.4%、43.8%;原代肝星状细胞SW-HSC、小鼠巨噬细胞系(RAW264.7)转染Lipidoid-GFP后经流式细胞仪检测,结果显示转染Lipidoid-GFP的SW-HSC及RAW264.7GFP阳性率分别为66.9%、75.8%,均显著高于对照组。结论小鼠实验结果表明,Lipidoid/siRNA-TIMP-1可有效降低肝脏TIMP-1水平,发挥抗肝纤维化作用。Lipidoid作为一种新型脂质载体可有效感染肝脏非实质细胞(肝星状细胞和Kuffer细胞)。

脂滴包被蛋白在非酒精性脂肪性肝病小鼠肝组织中的表达谱及瘦素基因敲除对其的影响

目的探讨不同饮食诱导的非酒精性脂肪肝病(NAFLD)小鼠肝组织中脂滴包被蛋白(Plin)家族的表达谱及瘦素基因敲除对其的影响。方法实验选用8周龄雄性C57BL/6小鼠53只,按照随机数字表法分组:CDAA对照组和模型组(9周组和15周组)、WD对照组和模型组(2周组、6周组和30周组),除CDAA9周对照组为5只,其余每组6只。选用4周龄雄性ob/ob小鼠12只,按照随机数字表法分组:对照组和模型组,每组6只。对照组给予正常饮食喂养;分别采用胆碱缺乏、L-氨基酸替代蛋白饲料(CDAA)和西方饮食(WD)诱导建立野生型C57BL/6小鼠NAFLD模型;采用WD饮食诱导建立瘦素基因敲除小鼠(ob/ob)NAFLD模型。实时荧光定量PCR法检测肝组织中Plin 2,Plin 3,Plin 4,Plin 5 mRNA的表达,比较不同组之间的差异及瘦素敲除对其的影响。结果正常野生型C57BL/6小鼠的肝组织中可检测出Plin 2,Plin 3,Plin 4,Plin 5四种亚型mRNA的表达;其中Plin 2是主要的亚型,其次为Plin 3、Plin 5,Plin 4的表达量最低。在CDAA饮食诱导的NAFLD模型中,Plin 2表达无显著变化;Plin 3表达在造模15周降低(P<0.05);Plin 4表达在造模9周和15周均升高(P<0.05);Plin 5表达在造模9周和15周均降低(P<0.05)。在WD饮食诱导的NAFLD模型中,野生型小鼠肝组织中Plin 2表达在造模30周增加(P<0.05);Plin 3、5表达无显著变化;Plin 4表达在造模2周、6周和30周均升高(P<0.05)。与野生型小鼠不同,在WD饮食诱导的(ob/ob)小鼠NAFLD模型中,肝脏中Plin 2、Plin 3、Plin 5表达降低(P<0.05);而Plin 4表达无显著变化。结论Plins基因表达谱在不同饮食诱导的NAFLD小鼠肝组织中存在显著差异;瘦素基因敲除抑制NAFLD小鼠肝组织中Plins基因的表达。

TGF-β1/Smads信号通路在肝脏纤维化中的作用研究进展

肝脏纤维化是多种致病因素持续作用于肝脏,导致慢性肝脏损伤后的共同结果。主要表现为细胞外基质（extracellular matrix,ECM）生成过多,降解相对不足,在肝脏内大量沉积,导致肝脏纤维化,此病理过程是可逆的。目前认为活化的肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）是肝脏纤维化发生时ECM的主要来源。

外泌体在肝脏纤维化中的研究进展

外泌体是由多种细胞通过胞吐作用分泌到体液中的膜包被小泡,介导细胞间信息交流以及调节细胞微环境,参与细胞生长、增殖、分化、凋亡,肿瘤生长、侵袭等多种生理病理活动.肝脏纤维化是细胞坏死以及炎症刺激等引起肝脏细胞外基质（extracellularmatrices,ECMs）过量产生并沉积的病理过程.肝星状细胞（hepaticstellatecells,HSCs）受多种信号通路调节,激活后可以向肌成纤维细胞（myofibroblasts,MF）转化,是引起肝脏纤维化的ECMs的主要来源.大量实验证明外泌体在肝脏纤维化发生发展过程中发挥着重要作用,在肝脏纤维化诊治中具有潜在的应用价值.

铁调素在小鼠急性肝损伤过程中的保护作用研究

目的明确铁调素(hepcidin)在小鼠急性肝损伤过程中对于肝细胞的保护作用。方法首先在野生型C57BL/6小鼠(WT小鼠)与hepcidin敲除小鼠(HAMP^(-/-)小鼠)分别建立四氯化碳(CCl_4)诱导的急性肝损伤模型,分别以橄榄油处理组作为对照组。然后检测天冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)的差异;通过苏木精-伊红染色法检测2种小鼠肝组织形态的变化;采用免疫组化的方法检测2种小鼠肝组织内肿瘤抑制基因P53与凋亡抑制基因Bcl-xl表达的差异;采用Real-time PCR(qPCR)检测2种小鼠肝组织内Fasl及Bcl-xl基因的表达情况;最后,采用流式细胞术检测hepcidin蛋白对于肿瘤坏死因子-α(TNF-α)与放线菌素D(Act D)诱导的肝细胞系NCTC 1469凋亡的抑制作用。结果 CCl_4暴露的HAMP^(-/-)小鼠血清中AST和ALT含量较CCl_4暴露的WT小鼠更高(升高倍数分别为2. 7倍和3. 7倍),并且两组差异具有统计学意义(分别为P <0. 05和P <0. 01);苏木精-伊红染色结果显示,在CCl_4暴露的HAMP^(-/-)小鼠中炎症细胞浸润较WT小鼠严重;免疫组化显示,肿瘤抑制基因P53含量在CCl_4暴露的HAMP^(-/-)小鼠较WT小鼠升高,而凋亡抑制基因Bcl-xl含量在CCl_4暴露的HAMP^(-/-)小鼠较WT小鼠降低; q PCR结果显示,Fasl在WT小鼠和HAMP^(-/-)小鼠的CCl_4组较其对照组(Olive组)升高,但HAMP^(-/-)小鼠经CCl_4刺激后,Fasl表达量较WT小鼠CCl_4组升高了1. 2倍,而凋亡抑制基因Bcl-xl的表达量在HAMP^(-/-)小鼠的CCl_4组为WT小鼠的CCl_4组的0. 9倍;体外实验中流式细胞术结果显示,hepcidin蛋白可以有效抑制TNF-α与Act D诱导的肝细胞凋亡。结论Hepcidin可以通过调控凋亡相关基因的表达,抑制肝细胞凋亡,进而发挥对急性肝损伤的保护作用。

铁调素通过抑制肝细胞凋亡在肝纤维化中的作用机制研究

目的明确在小鼠肝纤维化发生、发展过程中铁调素(hepcidin)的调控作用。方法将野生型C57BL/6(WT)小鼠和hepcidin基因敲除(HAMP-/-)小鼠按随机数字表法分为正常对照组(n=10)和四氯化碳(CCl 4)组(n=10)。正常对照组小鼠给予橄榄油灌胃,CCl 4组小鼠给予25%CCl 4(CCl 4︰橄榄油=1︰3)灌胃,每周2次,共6周。通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测CCl 4灌胃1周、4周和6周小鼠血清中hepcidin的水平;通过Masson染色和苏木精-伊红(HE)染色来分别观察CCl 4所诱导的小鼠肝脏纤维化严重程度,以及肝内的炎症水平;通过实时荧光定量PCR(qPCR)检测小鼠肝脏内纤维化相关基因Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)、Ⅲ型胶原(CollagenⅢ)和转化生长因子β(TGF-β)的表达,炎症相关基因白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达,以及凋亡相关基因Bax、Fas、Bcl-xl和Bcl 2的表达;最后采用流式细胞术检测hepcidin多肽对CCl 4诱导的小鼠肝细胞系NCTC1469细胞凋亡的调控作用。结果ELISA结果表明,随着肝纤维化进展,小鼠血清中hepcidin水平呈现出逐渐升高的趋势,在6周时最高,与正常对照组小鼠相比,升高约1.9倍,差异有统计学意义(P<0.01)。肝组织病理学结果显示,与WT型CCl 4组小鼠相比,HAMP-/-CCl 4组小鼠肝纤维化程度和肝脏炎症细胞浸润更严重。qPCR结果显示,与WT型CCl 4组小鼠相比,HAMP-/-CCl 4组小鼠其肝脏CollagenⅠ、CollagenⅢ和TGF-β的表达水平显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05);促炎性细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6表达水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05);促凋亡基因Bax和Fas的表达也呈现出上调趋势,凋亡抑制基因Bcl-xl和Bcl 2的表达呈下调趋势,差异均有统计学意义(P<0.05)。流式细胞仪分析结果显示,hepcidin可显著抑制CCl 4诱导的小鼠肝细胞系NCTC1469细胞凋亡。结论Hepcidin可以通过抑制肝脏细胞的凋亡进而抑制肝脏炎症和肝纤维化。

非酒精性脂肪性肝炎小鼠肝组织中脂蛋白脂肪酶及其相关调控因子的表达及二乙基二硫代氨基甲酸对其的调控作用

目的探讨脂蛋白脂肪酶(LPL)及其相关调控因子在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)小鼠肝组织中的变化和二乙基二硫代氨基甲酸(DDC)对其的调控作用。方法将15只雄性C57BL/6小鼠按照随机数字表法分为3组,每组5只。对照组给予普通饲料喂养;模型组给予胆碱缺乏的氨基酸(CDAA)饲料喂养,建立NASH模型;治疗组在采用高脂CDAA饲料喂养的同时给予DDC灌胃治疗。用Real-time PCR方法检测NASH小鼠肝组织中LPL及其活性相关调节因子的表达变化;探讨DDC对LPL及其活性相关调节因子的调控作用。结果模型组小鼠肝组织中LPL基因表达为3.527±1.389,显著高于对照组(1.233±0.887),LPL酶活性的负性调控因子血管生成素样蛋白ANGPTL3、ANGPTL4及载脂蛋白apoC-Ⅰ、apoC-Ⅲ的表达分别为0.060±0.045、0.396±0.203、0.292±0.159、0.145±0.058,均显著低于对照组(1.126±0.650、1.051±0.373、1.016±0.205、1.141±0.751),差异均有统计学意义(P<0.05)。治疗组小鼠肝组织中LPL基因表达为0.597±0.111,显著低于模型组(1.030±0.288),ANGPTL3、ANGPTL4、apoC-Ⅰ表达分别为1.284±0.181、2.040±0.602、1.514±0.369,均显著高于模型组(1.006±0.119、0.909±0.088、0.969±0.124),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论NASH小鼠肝组织中LPL表达升高,LPL酶活性抑制因子表达降低;DDC抑制LPL基因表达,并上调LPL酶活性的负性调控因子。

铁和铁调素在四氯化碳肝纤维化小鼠模型中的表达

目的利用四氯化碳(CCl_4)肝纤维化小鼠模型,动态观察小鼠肝纤维化发生发展过程中血清铁、肝脏组织铁的变化及血清铁调素(hepcidin)对铁代谢的影响,为临床抗肝纤维化治疗提供实验依据。方法利用8周龄的C57BL/6品系雄性小鼠分别给予CCl_4一周2次灌胃建立不同时期的肝纤维化模型,通过HE及Masson染色观察各组小鼠肝脏炎症、肝损伤及纤维化程度,并通过检测小鼠血清铁调素、血清铁、肝脏组织铁、膜铁转运蛋白的表达来评价小鼠肝纤维化过程中铁调素对铁代谢的影响。结果 CCl_4肝纤维化模型小鼠随造模时间的延长,纤维化程度逐渐加重,血清铁调素的表达呈递增趋势;血清铁及肝脏组织铁均呈先增加后降低的趋势,但两者出现峰值的时间点不同,且在CCl_4灌胃第6周仍高于正常对照组。血清膜铁转运蛋白随时间变化趋势与肝脏组织铁相似。结论在CCl_4诱导的肝纤维化小鼠模型中,随纤维化程度逐渐加重,血清铁调素的表达逐渐增加;血清铁、肝脏组织铁及膜铁转运蛋白的表达呈先增加后降低趋势,与铁调素调控体内铁代谢、维持铁稳态密切相关,同时也证实了肝纤维化过程中存在铁沉积。

原发性胆汁性胆管炎的诊疗进展

原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis,PBC)是一种慢性自身免疫性肝内胆汁淤积性疾病,未经有效治疗可进展至肝硬化、肝衰竭,其诊断主要靠肝内胆汁淤积特征(碱性磷酸酶和谷氨酰转肽酶水平升高,影像学排除肝外胆系梗阻)、抗线粒体抗体阳性和/或以小叶间胆管非化脓性炎症为主的病理特征。新型特异性抗核抗体如抗-gp210和抗-sp100联合检测有助于诊断抗线粒体抗体阴性的PBC。熊去氧胆酸是治疗本病的首选药物,但30%~40%的患者生化应答欠佳,贝特类药物和奥贝胆酸可作为此类患者的二线治疗。

二乙基二硫代氨基甲酸对肝星状细胞脂滴蛋白Perilipin 5表达及活化的影响

目的 探讨二乙基二硫代氨基甲酸(DDC)对肝星状细胞(HSCs)中脂滴蛋白Perilipin 5(Plin5)表达的调控作用及对HSCs活化的影响。方法 将雄性C57BL/6小鼠按随机数字表法分为3组:对照组给予正常饮食喂养;模型组给予胆碱缺乏、L-氨基酸替代蛋白饲料(CDAA)喂养,建立非酒精性脂肪性肝炎(NASH)纤维化模型;治疗组给予DDC灌胃治疗。GFAP和Plin5免疫荧光双染观察小鼠肝组织HSCs中Plin5表达,明确DDC对HSCs中Plin5表达的调控作用。应用DDC处理人肝星状细胞系LX-2,Real-time PCR方法检测Plin5表达,脂滴染色观察脂滴变化,明确DDC对LX-2细胞Plin5表达及脂滴形成的影响;Real-time PCR方法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及Ⅲ型胶原等的表达,明确DDC对LX-2细胞活化的影响。结果 在CDAA饮食诱导的NASH肝纤维化小鼠肝组织中,Plin5在HSCs中的表达较对照组显著降低;与模型组相比,DDC治疗组小鼠肝组织中Plin5在HSCs中表达显著升高。与对照组相比,DDC组处理12 h及24 h时,Plin5的mRNA相对表达量均显著增高(1.00±0.15 vs.1.93±0.70;1.00±0.33 vs.1.86±0.09),差异有统计学意义(P <0.05)。同时,LX-2脂滴染色结果显示,与对照相比,DDC组处理后LX-2细胞中脂滴数量显著增多[(0.71±0.12)%vs.(1.32±0.15)%],差异有统计学意义(P <0.05),且脂滴多位于细胞核周围,提示DDC可促进LX-2细胞恢复静止状态。与对照组相比,DDC组处理12 h及24 h时可显著抑制LX-2细胞中α-SMA、Ⅲ型胶原表达(1.00±0.07 vs.0.36±0.21;1.00±0.12 vs.0.66±0.02;1.00±0.04 vs.0.63±0.26;1.00±0.15 vs.0.76±0.07),差异均有统计学意义(P <0.05),提示DDC可抑制LX-2活化。结论 DDC可以上调HSCs中Plin5表达,促进脂滴形成并抑制HSCs活化。

内质网应激传递对肝星状细胞的影响

目的探究来源于肝细胞的内质网应激(ERS)信号对小鼠原代肝星状细胞(p-HSCs)的影响。方法在体外利用ERS激动剂衣霉素(TM)刺激小鼠肝细胞系AML1212 h,随后更换正常培养基培养16 h,收集细胞培养上清离心(ERS传递条件培养基),加入有p-HSCs的细胞培养皿中继续培养24 h。显微镜下观察细胞形态变化。采用Real-time PCR(qPCR)和蛋白质印迹法检测ERS相关指标GRP78、IRE1α、PERK、CHOP的表达,并进一步利用qPCR检测纤维化相关指标Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)、Ⅲ型胶原(CollagenⅢ)、转化生长因子β(TGFβ)的表达;以及凋亡相关基因Bax、Fas和Bcl 2的表达。结果显微镜下观察细胞形态,发现加有TM的AML12细胞与对照组相比,出现细胞皱缩变圆,胞质浓缩,细胞生长受到抑制;加有相应ERS传递条件培养基的p-HSCs细胞形态未发生明显变化,细胞生长轻微受抑制。与正常对照相比,经TM刺激后的AML12细胞,ERS相关基因GRP78、PERK分别升高12.4倍和1.5倍,同时ERS相关蛋白GRP78、PERK、P-PERK的表达也增加2.0、1.8、2.0倍,差异有统计学意义(P<0.05)。接受ERS传递的p-HSCs与未接受ERS信号的对照组相比,GRP78、IRE1α、PERK、CHOP基因表达分别升高1.3、1.3、1.18和1.3倍,GRP78、IRE1α、ATF6蛋白表达水平也升高1.6、2.0、1.8倍,差异有统计学意义(P<0.05)。接受ERS传递的p-HSCs促凋亡基因Bax、Fas的表达显著上调(分别升高2.2、1.2倍),抑制凋亡基因Bcl 2表达下调(为对照组的60%),差异有统计学意义(P<0.05);而HSC纤维化相关基因TGFβ、CollagenⅠ、CollagenⅢ的表达两组之间未见明显差异。结论ERS可以从肝细胞传递至HSCs,并可诱导HSCs凋亡。

MT1DP通过调控Cav1.3促进镉诱发的细胞死亡效应

目的检测重金属镉暴露下长链非编码RNA MT1DP对钙内流和胞内镉摄入的影响,并探讨其分子机制。方法首先采用特异性钙通道抑制剂维拉帕米(VER)处理HepG2细胞,然后采用钙离子荧光探针Fluo-3AM检测镉对细胞钙流的影响,并使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定胞内镉的含量;采用Real-timeqPCR检测镉对细胞内MT1DP表达水平的影响;采用shRNA敲低胞内MT1DP含量后检测其对镉暴露下胞内镉摄入量的影响;采用qPCR和Western blotting检测镉暴露下MT1DP对钙通道蛋白Cav1.3mRNA和蛋白表达水平的影响;采用siRNA敲低Cav1.3含量后检测镉暴露下其对细胞钙流、胞内镉的摄入量和细胞死亡效应的影响;最后采用AKT通路抑制剂检测镉暴露下AKT对Cav1.3表达水平的影响,并且过表达AKT后检测其对Cav1.3表达水平和胞内镉摄入量的影响。结果钙通道被抑制后细胞镉的摄入明显减少,在镉的暴露下肝癌细胞内MT1DP的表达显著增加,而当抑制MT1DP的表达水平后,镉诱发的胞内镉的摄入也显著降低;同时,抑制MT1DP可以降低镉暴露后细胞内Cav1.3基因和蛋白表达水平。当抑制Cav1.3的蛋白表达水平时,镉诱发的钙内流、胞内镉的摄入和细胞死亡效应也都显著降低。此外,抑制AKT的表达可以抑制Cav1.3的表达水平,而当细胞内过表达AKT后,镉暴露下Cav1.3的诱导表达水平和镉诱发的胞内镉摄入也显著增加。结论MT1DP可以通过活化AKT/Cav1.3信号通路促进钙内流和胞内镉摄入,最终诱发细胞死亡。

乙型肝炎临床治愈:共识与争议

乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)感染是严重的全球公共卫生问题。目前临床治愈是乙肝治疗的理想终点,即患者完成治疗后血清乙肝病毒表面抗原阴性,伴或不伴乙肝病毒表面抗体出现,HBV DNA检测不到,肝脏生物化学指标正常,肝脏组织病变得到改善。然而,基于现有的治疗药物难以获得令人满意的临床治愈效果,为此,科学工作者们进行了诸多探索,不论是联合核苷(酸)类似物和聚乙二醇干扰素的治疗策略,还是适时终止抗病毒药物治疗,抑或是加速创新药物的研发,目前都充满着机遇与争议。乙肝临床治愈之路道阻且长,但行则将至,我们始终相信,经过不懈努力,帮助慢性乙肝患者获得临床治愈甚至完全治愈的梦想终会实现。

乙型肝炎创新药物临床试验设计的方法学考量

近年来以慢性乙型肝炎临床治愈为目标的新药研发进入活跃期。在针对乙型肝炎的新药临床试验中,采用设计新理念、新方法、新技术来评价创新药物的疗效,有望缩短候选新药的临床研究过程、降低新药开发成本。但是,无缝适应性设计、主方案设计等新型设计在乙型肝炎创新药物临床试验中的实际应用尚少。现将聚焦乙型肝炎创新药物II/III期临床试验设计的方法学考量,重点介绍临床试验新型设计,以期为乙型肝炎创新药物的研发提供方法学参考。