利用人诱导多能干细胞构建心脏类器官方法的研究

目的:探索人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)分化为心脏类器官的方法。方法:首先通过免疫荧光染色验证hiPSCs多能性标志物的表达;之后将hiPSCs培养为拟胚体(embryoid bodies,EBs),利用双向调控WNT(wingless and Int-1,WNT)信号通路法诱导EBs向心脏类器官分化,记录分化过程中的形态变化。最后,通过免疫荧光染色、实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和微电极阵列(multi-electrode array,MEA)技术检测心脏类器官的细胞成分、基因表达谱、电生理特性和收缩舒张功能,验证心脏类器官分化方案的有效性。结果:免疫荧光染色显示hiPSCs中OCT4和SSEA4高表达。利用双向调控WNT信号的方法成功诱导hiPSCs产生跳动的心脏类器官。免疫荧光染色表明心脏类器官中cTNT阳性心肌细胞比例为(59.3±12.8)%,非心肌细胞比例为(40.7±12.8)%。qRT-PCR结果表明其中非心肌细胞包括平滑肌细胞、成纤维细胞及内皮细胞。与分化15D相比,分化30D的类器官中心肌成熟相关基因和心脏各项功能相关基因表达水平更高。MEA检测结果显示,随分化时间增加,类器官逐渐具备类似在体心脏的电生理特征,跳动频率减小[分化15d时跳动(58±5)vs.30d(38±5)次/min],收缩幅度增加15d时收缩幅度[(8.57±3.7)vs.30d(16.4±5.9)%]。结论:通过该方法能使hiPSCs分化出成熟且有功能的心脏类器官。

单细胞转录谱揭示小鼠心肌缺血再灌注后心肌细胞的异质性研究

目的:利用单细胞转录组测序(single-cell transcriptome sequencing,sc RNA-seq)的方法,探究小鼠心肌缺血再灌注(myocardial ischemia/reperfusion,MI/R)损伤后心肌细胞的异质性。方法:首先对C57BL/6J小鼠进行心肌缺血再灌注损伤模型的构建,分别对假手术组和MI/R术后24h小鼠心脏进行消化酶液灌流以分离获得单个小鼠心肌细胞。利用ICELL8?Single-Cell System平台进行单细胞转录组建库,后进行降维聚类和差异分析,以探究心肌细胞的异质性。结果:1029个心肌细胞主要分为三个亚群。相比较于假手术组,其中cluster 1在MI/R后增多,并发挥组蛋白乙酰化功能。Cluster 2在MI/R后减少,主要具有负调控血管新生,调节细胞周期等功能。Cluster 3在MI/R后数量几乎没有变化,主要发挥维持心脏发育的功能。并且在MI/R后,各心肌细胞亚群的基因同样发生显著变化。结论:以上结果表明,小鼠在缺血再灌注损伤后,心肌细胞具有显著异质性。

橙皮素减轻胸主动脉瘤/夹层发生发展作用的实验研究

目的:探究橙皮素对胸主动脉瘤/夹层形成的作用。方法:利用β-氨基丙腈(BAPN)饮水28 d的方法构建小鼠主动脉瘤/夹层模型。选择C57BL/6小鼠20只,分为实验组(n=10)和对照组(n=10),实验组自第一天开始饮用含有BAPN(1 g·kg^-1·day^-1)的ddH2O,对照组饮用普通ddH2O。采用大体图和弹力纤维染色观察每周主动脉变化情况。②选取C57BL/6小鼠40只,分为橙皮素20 mg/kg组(n=10)、橙皮素50 mg/kg组(n=10)、对照组(n=10)。在第14天开始给药, 1次/d,实验组给予相应剂量橙皮素溶液,对照组给予等量0. 9%氯化钠溶液。实验结束后处死存活小鼠,统计TAAD发生率和病死率;大体图观察血管直观变化;采用弹力纤维染色观察胸主动脉弹力纤维板断裂情况。③荧光标记法检测橙皮素处理后Hep G2细胞上清中基质金属蛋白酶(MMPs)活性变化;原位荧光明胶酶染色检测小鼠主动脉组织上明胶酶(MMP-2、MMP-9)活性表达。结果:给予BAPN饮水28 d的小鼠生存曲线较普通饮水组,差异有统计学意义(P<0.001),且从第14 d天后的小鼠胸主动脉开始出现不同程度病理变化,并随着时间加重。橙皮素50 mg/kg实验组与0. 9%氯化钠溶液对照组相比,小鼠病死率和TAAD形成率明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),且主动脉扩张程度减轻,弹力纤维紊乱与断裂有明显改善。20 mg/kg实验组也有类似效果,但不如前者明显。此外,橙皮素处理后的Hep G2细胞上清中MMPs活性明显下降(P<0.0001);实验组小鼠主动脉组织上明胶酶活性减弱。结论:橙皮素能够减轻主动脉瘤/夹层的发生发展,其机制可能与抑制基质金属蛋白酶活性有关。

雌激素抑制脂滴包被蛋白Perilipin 2减少肝细胞脂质沉积

目的:研究雌激素减少导致肝细胞脂质沉积的可能机制,为围绝经期女性非酒精性脂肪肝的研究奠定实验基础。方法:采用油酸诱导建立肝细胞脂肪变性模型,设置DMSO对照组、油酸模型组、油酸+雌激素实验组,尼罗红染色法鉴定肝细胞内脂质沉积情况。免疫荧光染色和蛋白免疫印记实验检测脂滴包被蛋白Perilipin2(Plin2)的表达变化。结果:成功建立油酸诱导肝细胞脂肪变性模型,尼罗红染色可见高亮橘红色的脂滴形成。雌激素剂量依赖性的减少油酸诱导的肝细胞内脂质沉积。免疫荧光染色显示雌激素能够明显抑制油酸诱导的Plin2的表达,荧光信号降低。蛋白免疫印迹实验证实雌激素能够减少Plin2的蛋白表达水平,DMSO对照组、油酸诱导模型组和雌激素实验组Plin2蛋白表达相对光密度分别为0.409±0.051、0.739±0.060、0.438±0.061,雌激素显著性减少了油酸诱导的Plin2的蛋白表达水平(P<0.05)。结论:雌激素能够减少肝细胞内的脂质沉积,可能是通过抑制脂滴包被蛋白Plin2而实现。

急性主动脉夹层患者补体活化及补体C3a受体表达的临床意义

目的:揭示急性主动脉夹层发生中,是否存在补体系统活化及补体活化产物C3a受体的表达变化。方法:收集2015年1月至2015年7月,在北京安贞医院接受体检的正常人、腹主动脉瘤手术以及急性主动脉夹层手术患者血液各5例,进行微量样本多指标流式蛋白定量试验,测定其补体系统活化产物过敏毒素C3a、C4a和C5a的水平;收集2015年1月至2015年7月,在北京安贞医院接受主动脉弓部替换术患者的升主动脉组织5例及心脏移植供受体正常的升主动脉组织5例,进行免疫组化组织染色,并提取蛋白,检测C3a受体的表达。结果:微量样本多指标流式蛋白定量试验结果显示,腹主动脉瘤和急性主动脉夹层患者血浆中补体活化产物C3a、C4a和C5a含量显著高于正常对照组(P<0.01),这说明补体活化不仅在腹主动脉瘤,急性主动夹层患者循环系统也存在。免疫印迹结果显示急性主动脉夹层患者标本中C3a受体蛋白表达量显著高于正常对照组(P<0.05)。免疫组化染色发现,与正常升主动脉壁相比较,急性主动脉夹层标本的C3a受体表达显著增高(P<0.01)。结论:急性主动脉夹层患者体内存在补体系统活化C3a-C3a受体信号通路,可能参与主动脉夹层的发生发展。

新型主动脉夹层免疫缺陷动物模型的建立

目的:构建缺乏免疫反应的新型主动脉夹层(AD)动物模型,并研究不同的造模药物剂量,为探讨人源性活性物质在AD发生发展中的作用奠定实验基础。方法:将52只裸鼠随机分为实验组(42只)和对照组(10只)。实验组42只随机分为A、B、C、D四组,使用不同剂量给予β-氨基丙腈(BAPN)饮水28d和血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)皮下灌泵24h;对照组正常饮水28d。每7天测量一次体质量,观察体质量改变;第28天处死存活裸鼠,观察血管直观变化,使用HE和EVG染色观察形态学改变,并计算各组AD形成率及破裂率。结果:对照组无AD形成,实验组部分小鼠可见明显的主动脉扩张及壁内血肿,血管可见内膜撕裂、血细胞进入管壁,弹力纤维紊乱或断裂,证实形成AD。实验A、B、C、D组形成率分别为50%、90%、70%及80%,破裂率分别为41.67%、80%、20%及70%。结论:成功构建简单、方便的主动脉夹层免疫缺陷动物模型,并形成不同的形成、破裂率,以适应不同研究方案。