心肌肌球特定基因-肌球蛋白轻链基因可在人脐带间充质干细胞诱导分化为心肌样细胞表达

目的:探讨人心肌肌球蛋白轻链(2v)基因启动子(p MLC2v)驱动的绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶(Luc)报告基因慢病毒载体在人脐带间充质干细胞(h UCMSC)向心肌样细胞分化中的表达。方法:酶消化法原代分离培养h UCMSC,采用流式细胞仪鉴定分析其细胞表面标记物及检测体外向成骨细胞、成脂细胞、内皮细胞诱导分化潜能;经5-氮杂胞苷(5-Aza)诱导h UCMSC定向分化成心肌样细胞;诱导细胞并同时转染p MLC2v-GFP,于d3,d7,d10,d14,d17及d21时间点在荧光显微镜下观察及流式细胞仪检测其阳性率;用生物发光检测仪检测相同时间点的萤光素酶(p MLC2v-Luc)报告基因慢病毒载体转染分化细胞发光特征;在激光共聚焦显微镜下观察p MLC2v-GFP及红色荧光蛋白(RFP)共转染诱导21d后分化细胞蛋白的表达分布状况;与鼠心肌细胞作为对照,脉冲电流激发细胞收缩和细胞内及细胞间的钙离子流,以检测诱导分化细胞"兴奋-收缩"偶联功能;Western blot法检测诱导分化细胞p MLC2v蛋白的表达。结果:原代培养的P3 h UCMSC,经FCM检测CD90、CD105及CD73阳性率均为99%以上为高表达;获得的细胞分别经体外诱导能够向成骨细胞、成脂细胞、成内皮细胞分化;经5-氮杂胞苷(5-Aza)诱导h UCMSC同时并转染p MLC2v GFP,在荧光显微镜下观察并用流式仪检测GFP表达阳性细胞数随诱导时间的延长而增加(P<0.05);生物发光检测仪检测诱导细胞p MLC2v-Luc表达同样呈阳性递增;p MLC2v GFP及RFPC共转染诱导21d后分化的细胞,细胞浆内形成较清晰的与细胞长轴平行的肌束样结构;诱导后的细胞用共聚焦显微镜检测无细胞内及细胞间的钙离子流动;随诱导时间的延长p MLC2v蛋白表达明显增加(P<0.05)。结论:在h UCMSC体外诱导形成心肌样细胞过程中,p MLC2v基因随诱导时间的延长而表达增加,为监测干细胞的移植在心肌疾病治疗中提供了实验依据。

多次移植人脐带间充质干细胞对大鼠Th1和Th2比值的影响

目的：观察多次静脉移植人脐带间充质干细胞（human umbilical mesenchymal stem cells,HUMSCs）对大鼠Th1和Th2轴的影响.方法：①体外培养HUMSCs;流式细胞仪鉴定第4代hUMSCs表面抗原的表达；特异性诱导染色并鉴定第4代HUMSCs分化脂肪细胞和成骨细胞的潜能；②雄性SD大鼠30只,体质量182～203g,分为3组：空白对照组；0.9％氯化钠液组；干细胞移植组,每组10只.干细胞移植组：1次/w经尾静脉注射3.5×107/kg的HUMSCs,连续3次.第三次移植HUMSCs后11d,各组经腹主动脉取血,流式细胞仪检测T淋巴细胞的IFN-γ和IL-4阳性率.结果：3次注射干细胞后实验动物全部存活,干细胞组的Th1、Th2阳性率较0.9％氯化钠液组差异无统计学意义（P＞0.05）；Th1/Th2比值、血清IFN-γ和IL-4水平与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；干细胞组的心、脑、肺、肝及肾等脏器未发生病理改变.利用红色荧光蛋白转染的HUMSCs示踪,发现移植的HUMSCs大部分归巢于骨髓中.结论：多次尾静脉注射HUMSCs,未引起大鼠Th1、Th2细胞免疫和体液免疫系统的变化,Th1/Th2轴无明显改变.移植的HUMSCs能较长时间的存活于大鼠骨髓内,具有较好的免疫相容性.