117株结核分枝杆菌临床分离株对注射用抗结核药物耐药水平的研究

目的对临床Mtb菌株进行链霉素（Sm）、卡那霉素（Km）、阿米卡星（Am）、卷曲霉素（Cm）的药物敏感性试验（简称“药敏试验”），了解其耐药程度和交叉耐药水平。方法采用微孔板Alamarblue试验（microplate Alamar Blueassay，MABA），检测117株Mtb临床分离菌株的Sm、Km、Am和Cm的体外最低抑菌浓度（MIC）值。Sm、Km、Am、Cm的临界浓度分别为2、4、1、2．5μg／ml。将Sm、Km、Am的MIC值大于临界浓度≤16μg／ml、32-64μg／ml、〉64μg／ml分别为低度耐药、中度耐药、高度耐药；Cm的MIC值大于l临界浓度≤20μg／ml、40～80μg/ml、〉80μg／ml分别为低度耐药、中度耐药、高度耐药。结果117株临床分离株中，83株耐Sm，其中63株（75．9％）为高度耐药，18株（21．7％）为低度耐药，2株（2．4％）中度耐药；23株耐Km和19株耐Am的耐药株中分别有78．3％（18／23）和94．7％（18／19）高度耐药，其余分别为两药的低度耐药菌株，未发现中度耐Km或Am的菌株；14株Cm耐药株的MIC值都在5～20μg／ml，未发现高度耐药株。83株Sm耐药的菌株中有27．7％（23／83）和22．9％（19／83）分别对Km和Am耐药，71．1％（59／83）对Am和Km均敏感。Km耐药株和Am耐药株中分别有78．3％（18／23）和94．7％（18／19）同时耐Km和Am（x^2=-1．157，P〉0．05），且对Km和Am均高度耐药；5株对Kin低度耐药，但对Am敏感。Am耐药株和Cm耐药株中，分别有68．4%（13／19）和92．9％（13／14）同时耐Am和Cm。结论耐Sm或Km或Am的Mtb临床分离株绝大多数为高度耐药，耐Cm的Mtb临床分离株以低度耐药为主；绝大多数的Sm高度耐药株仍对Am、Km敏感；高度耐Am或Km的菌株互为为完全交叉耐药，Km低度耐药的菌株对Am敏感；Am高度耐药株多数对Cm为低度耐药，绝大多数Cm耐药株对Am高度耐药。

两种国产抗结核固定剂量复合剂中利福平的药代动力学和生物等效性研究

目的研究两种国产抗结核固定剂量复合剂四药复方中利福平的药代动力学和相对生物利用度，评价复合剂中利福平的生物等效性，以期揭示抗结核固定剂量复合剂的内在质量，为临床合理用药提供理论依据。方法复合剂作为受试制剂，利福平胶囊作为参比制剂，采用单次给药自身交叉对照的方法，考察两种受试制剂分两批试验进行，按照编号法将每批18名健康男性受试者随机分为2组，每组9名，第一批试验中组1受试者在第一周口服受试制剂1，每批试验入组18名受试者，两批试验共计入组36名受试者。第二周口服参比制剂，组2受试者在第一周口服参比制剂，第二周口服受试制剂1，每名受试者每周各服一次药物；第二批试验中受试制剂1改为受试制剂2，其他操作不变。服药后，抽取不同时间点受试者的静脉血，采用液相色谱质谱联用法测定血药浓度，应用DAS3．1．5版软件计算药代动力学参数及判断生物等效性。结果两种固定剂量复合剂中利福平主要药代动力学参数分别如下，峰浓度（Cmax）为（11．4±3．4）mg／L和（12．2±3．8）mg／L，半衰期（T1／2）为（3．7±1．2）h和（3．6±1_3）h，时间点0至24h的血药浓度一时间曲线下面积（AUC（0-t））为（91．4±30．8）mg·L-1·h-1和（92．1±25．3）mg·L-1·h-1，时间点0至无穷大时血药浓度时间曲线下面积（AUC（0-∞））为（93．3±31．3）mg·L-1·h-1和（94．1±26．5）mg·L-1·h-1。AUC（0-t）相对生物利用度分别为94．7％和91．4％，置信区间为89．5％～100．2％和81．4％～95．6％，等效区间为80％～125％。结论两种受试制剂中利福平的Cmax、Tmax与参比制剂比较均无显著性差异。经生物等效性检验，判定两种受试制剂中利福平与参比制剂中利福平生物等效。

耐药结核病患者利奈唑胺血药浓度对血液系统毒性发生的影响

目的:分析应用利奈唑胺的耐药结核病患者的血药浓度对发生血液系统毒性的影响,并探索血液系统毒性发生的其他危险因素。方法:采用前瞻性队列研究方法,连续纳入首都医科大学附属北京胸科医院2019年1月至2021年2月应用含利奈唑胺化疗方案治疗的耐药结核病患者作为研究对象,共219例。收集研究对象的临床资料及服药后2 h的血液标本。应用高效相色谱-质谱法测定利奈唑胺的血药浓度。通过绘制受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC曲线)确定血药浓度(峰浓度)对血液系统毒性的诊断价值,并确定最佳诊断临界值;采用多因素logistic回归分析研究对象发生血液系统毒性的影响因素。结果:219例研究对象中有92例(42.0%)发生了血液系统毒性反应,包括白细胞计数减少[15.5%(34/219)]、贫血[21.5%(47/219)]、血小板减少症[27.4%(60/219)]等,127例(58.0%)未发生任何相关毒性反应。发生血液系统毒性者利奈唑胺血药峰浓度为17.1(11.8,22.8)μg/ml,明显高于未发生者[14.7(10.4,18.0)μg/ml],差异有统计学意义(Z=-3.206,P=0.001)。未发生血液系统毒性者中的血清白蛋白<40 g/L者的比例为29.1%(37/127),明显低于血清白蛋白≥40 g/L者的比例[70.9%(90/127)],差异有统计学意义(χ2=7.998,P=0.005)。ROC曲线分析显示,利奈唑胺血药峰浓度对血液系统毒性有预测价值(曲线下面积为0.627),血药峰浓度为20.7μg/ml时是最佳诊断点。多因素logistic回归分析显示,血清白蛋白<40 g/L者血液系统毒性发生的风险是血清白蛋白≥40 g/L者的2.622倍(OR=2.622,95%CI:1.344~5.117);利奈唑胺血药峰浓度>20.7μg/ml者血液系统毒性发生的风险是血药峰浓度≤20.7μg/ml者的6.419倍(OR=6.419,95%CI:2.874~14.337)。结论:利奈唑胺引起的血液系统毒性发生比例高,尤其对于血清白蛋白<40 g/L和利奈唑胺血药峰浓度>20.7μg/ml的患者在应用利奈唑胺治疗时,应警惕血液系统毒性的发生。

两种国产抗结核固定剂量复合剂中利福平的药代动力学和生物等效性研究

目的研究两种国产抗结核固定剂量复合剂四药复方中利福平的药代动力学和相对生物利用度，评价复合剂中利福平的生物等效性，以期揭示抗结核固定剂量复合剂的内在质量，为临床合理用药提供理论依据。方法复合剂作为受试制剂，利福平胶囊作为参比制剂，采用单次给药自身交叉对照的方法，考察两种受试制剂分两批试验进行，按照编号法将每批18名健康男性受试者随机分为2组．每组9名，第一批试验中组1受试者在第一周口服受试制剂l，每批试验入组18名受试者，两批试验共计入组36名受试者。第二周口服参比制剂，组2受试者在第一周口服参比制剂，第二周口服受试制剂1，每名受试者每周各服一次药物；第二批试验中受试制剂l改为受试制剂2，其他操作不变。服药后，抽取不同时间点受试者的静脉血，采用液相色谱一质谱联用法测定血药浓度，应用DAS3．1．5版软件计算药代动力学参数及判断生物等效性。结果两种固定剂量复合剂中利福平主要药代动力学参数分别如下，峰浓度（Cmax为（11．4±3．4）mg／L和（12．2±3．8）mg／L，半衰期（T1/2）为（3．7±1．2）h和（3．6±1．3）h，时间点0至24h的血药浓度一时间曲线下面积（AUC（0-t）为（91．4±30．8）mg·L^-1·h^-1和（92．1±25．3）mg·L^-1·h^-1，时间点0至无穷大时血药浓度一时间曲线下面积（AUC（n-∞）为（93.3±31．3）mg·L^-1·h^-1和（94．1±26．5）mg·L^-1·h^-1。AUC（0-t）相对生物利用度分别为94．7％和91．4％，置信区间为89．5％～100．2％和81．4％~95．6％，等效区间为80％~125％。结论两种受试制剂中利福平的Cmax、Tmax与参比制剂比较均无显著性差异。经生物等效性检验，判定两种受试制剂中利福平与参比制剂中利福平生物等效。

结核分枝杆菌对PA-824耐药的体外诱导及稳定性研究

目的体外诱导并获得结核分枝杆菌（MTB）对PA-824的耐药菌株。方法选取MTB标准株H37Rv，在PA-824浓度二倍递增的含药培养基上进行传代培养，逐步诱导菌株对PA-824耐药，测定多种抗结核药物对PA-824耐药株的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC），并对耐药株测序鉴定ddn和fgd1基因的突变情况。将耐药株在无药固体培养基上连续传代培养10代以观察耐药稳定性。结果H37Rv经逐步诱导后得到5株MTB单克隆，它们对PA．824的MIC值是诱导前8倍以上，且对TBA．354同时发生交叉耐药。测序结果显示fgd1基因未发生突变，但5株均检测到ddn基因突变。耐药株在无药固体培养基上连续传代10代后，MIC值无明显变化。结论通过二倍递增体外诱导可以获得对2种硝基咪唑类（nitroimidazoles）药物均耐药的MTB菌株；MTB对硝基咪唑类药物的耐药可能与ddn基因突变有关；MTB对硝基咪唑类药物的耐药稳定性较强，不易复敏。

14种抗结核药物在巨噬细胞内的抗结核活性评价

目的测定14种抗结核药物在巨噬细胞内的抗结核活性,并评价体外巨噬细胞内抗结核活性测定对新药筛选的作用。方法采用结核分枝杆菌标准株H37Rv感染J774.1巨噬细胞,建立体外巨噬细胞感染模型。分别检测利福平、异烟肼、左氧氟沙星、吡嗪酰胺、贝达喹啉、氯苯吩嗪、利奈唑胺、硝基咪唑类药物PA-824、氯苯吩嗪的衍生物TBI-166、利奈唑胺的同类药物OTB-658,以及苯并噻嗪类药物PBTZ-169和BTZ-043、TZY-5-84、NTB-3119H作用后的巨噬细胞中的细菌载量,评价抗结核药物的胞内活性;并采用微孔培养显色法(MABA法)测定上述药物的体外最低抑菌浓度。从中选取利福平、异烟肼、左氧氟沙星、贝达喹啉、氯苯吩嗪、利奈唑胺、TBI-166、PBTZ-169分别作用J774.1巨噬细胞3h,利用高效液相色谱-质谱/质谱联用技术测定细胞内药物浓度。结果细胞培养基中药物浓度为0.50μg/ml时,异烟肼、PBTZ-169、贝达喹啉、BTZ-043、NTB-3119H、TZY-5-84和PA-824降低巨噬细胞内结核分枝杆菌1.60、1.33、1.31、1.25、1.13、1.01和1.00lg(CFU/ml)(CFU:菌落形成单位),胞内活性最强的是异烟肼和PBTZ-169,其次是贝达喹啉;但吡嗪酰胺、利奈唑胺、TBI-166和OTB-658仅降低巨噬细胞内结核分枝杆菌0.65、0.55、0.33和0.31lg(CFU/ml)。经体外90%最低抑菌浓度(MIC90)和胞内活性比较,发现利奈唑胺和OTB-658虽然具有良好的体外抗菌活性(MIC90分别为0.25和0.05μg/ml),但是二者在细胞培养基中浓度为5μg/ml时仅降低巨噬细胞内结核分枝杆菌0.77和0.50lg(CFU/ml)。在培养基中药物浓度为20μg/ml时,PBTZ-169、贝达喹啉、氯苯吩嗪、利福平、TBI-166、异烟肼、左氧氟沙星和利奈唑胺在巨噬细胞内的浓度为1.42、2.11、4.93、1.65、0.50、0.27、1.13和0.32μg/ml,胞内药物浓度是其MIC90(分别为0.0005、0.03、0.12、0.05、0.04、0.05、0.25、0.25μg/ml)的2840.00、70.33、41.08、33.00、12.50、5.40、4.52和1.28倍。结论各药物进入巨噬细胞的能力并不相同,巨噬细胞内抗菌活性的差异提示细胞内药物浓度及与MIC90的关系是细胞内活性的决定因素。

14种抗结核药物在巨噬细胞内的抗结核活性评价

目的测定14种抗结核药物在巨噬细胞内的抗结核活性,并评价体外巨噬细胞内抗结核活性测定对新药筛选的作用。方法采用结核分枝杆菌标准株H37Rv感染J774.1巨噬细胞,建立体外巨噬细胞感染模型。分别检测利福平、异烟肼、左氧氟沙星、吡嗪酰胺、贝达喹啉、氯苯吩嗪、利奈唑胺、硝基眯唑类药物PA-824、氯苯吩嗪的術生物TBI-166、利奈唑胺的同类药物OTB-658,以及苯并噻嗪类药物PBTZ-169和BTZ-043、TZY-5-84、NTB-3119H作用后的巨噬细胞中的细菌载量,评价抗结核药物的胞内活性;并采用微孔培养显色法(MABA法)测定_上述药物的体外最低抑菌浓度。从中选取利福平、异烟肼、左氧氟沙星、贝达喹啉、氯苯吩嗪、利奈唑胺、TBI-166、PBTZ-169分别作用J774.1巨噬细胞3 h,利用高效液相色谱-质谱/质谱联用技术测定细胞内药物浓度。结果细胞培养基中药物浓度为0.50μg/ml时,异烟肼、PBTZ-169、贝达喹啉、BTZ-043、NTB-3119H、TZY-5-84和PA-824降低巨噬细胞内结核分枝杆菌1.60、1.33、1.31、1.25、1.13、1.01和1.00 lg(CFU/ml)(CFU:菌落形成单位),胞内活性最强的是异烟肼和PBTZ-169,其次是贝达喹啉;但吡嗪酰胺、利奈唑胺、TBI-166和OTB-658仅降低巨噬细胞内结核分枝杆菌0.65、0.55、0.33和0.31 lg(CFU/ml)。经体外90%最低抑菌浓度(MIC90)和胞内活性比较,发现利奈唑胺和OTB-658虽然具有良好的体外抗菌活性(MIC90分别为0.25和0.05μg/ml),但是二者在细胞培养基中浓度为5μg/ml时仅降低巨噬细胞内结核分枝杆菌0.77和0.50 lg(CFU/ml)。在培养基中药物浓度为20μg/ml时,PBTZ-169、贝达喹啉、氯苯吩嗪、利福平、TBI-166、异烟肼、左氧氟沙星和利奈唑胺在巨噬细胞内的浓度为1.42、2.11、4.93.1.65.0.50、0.27.1.13和0.32μg/ml,胞内药物浓度是其MIC90(分别为0.0005、0.03、0.12、0.05、0.04、0.05、0.25、0.25μg/ml)的2840.00、70.33、41.08、33.00、12.50、5.40、4.52和1.28倍。结论各药物进入巨噬细胞的能力并不相同,巨噬细胞内抗菌活性的差异提示细胞内药物浓度及与MIC90的关系是细胞内活性的决定因素。

IFN-γ和IL-10作为药物抗结核活性评价指标的可行性考察

目的探讨细胞因子是否可以作为一项指标评价药物对小鼠结核模型的疗效。方法75只BALB／c小鼠雾化感染建立小鼠结核模型，分为13组，药物治疗2月以后，取血并做全肺活菌（CFU）计数；ELISA法检测血清中的γ-干扰素（IFN—γ）和白介素10（IL-10）的浓度；以全肺活菌计数作为药物对小鼠结核活性的标准，检验血中的γ-干扰素和白介素10的含量及二者的比值与小鼠肺中全肺活菌的相关性并进行线性回归。结果①全肺活菌计数：除左氧氟沙星（Lfx）和对氨基水杨酸（PAS）组以外，其余各治疗组与空白对照组相比均有统计学差异；各治疗组与阳性对照组（利福平＋异烟肼＋吡嗪酰胺，RHZ）相比均有统计学差异。②γ-干扰素：除左氧氟沙星、对氨基水杨酸组以外的各治疗组与空白对照组均有统计学差异，各治疗组与阳性对照组相比没有统计学差异。③白介素10：各治疗组与空白对照组、各治疗组之间均没有统计学差异。④γ-干扰素／白介素10：氯法齐明、利奈唑胺＋丙硫异烟胺、利奈唑胺＋氯法齐明、利奈唑胺＋阿米卡星、利福平＋异烟肼＋吡嗪酰胺组与空白对照组相比有统计学差异，各治疗组之间均没有统计学差异。⑤γ-干扰素、白介素10、γ-干扰素／白介素10与全肺活菌呈正相关，确定因子，2分别为0．688、0．237、0．582。结论外周血中γ-干扰素的含量可以用来判断治疗方案是否有效，但不适宜作为生物标记物来预测体内结核菌的数量。

254例耐药肺结核患者克拉霉素耐药情况及影响因素分析

目的分析耐药肺结核患者克拉霉素耐药情况及相关危险因素,为其临床应用提供依据。方法收集2017年1月至2018年1月在首都医科大学附属北京胸科医院确诊为耐药肺结核的254例患者的临床资料和药物敏感性试验(简称"药敏试验")结果进行回顾性分析。采用比例法对克拉霉素等16种抗结核药物进行药敏试验检测。采用logistic回归法分析克拉霉素耐药的临床相关危险因素。结果 (1)254例耐药肺结核患者中,17例耐多药/广泛耐药患者对克拉霉素耐药,耐药率为6.69%(17/254),低于其余15种抗结核药物[12.60%(32/254)~95.67%(243/254)]。(2)对克拉霉素耐药的耐多药/广泛耐药患者,对莫西沙星(47.06%,8/17)、氯法齐明(70.59%,12/17)、乙胺丁醇(82.35%,14/17)、阿米卡星(52.94%,9/17)、对氨基水杨酸(76.47%,13/17)、对氨基水杨酸异烟肼(88.24%,15/17)、卷曲霉素(76.47%,13/17)的耐药率均高于对克拉霉素敏感的患者[莫西沙星(11.32%,24/212)、氯法齐明(9.91%,21/212)、乙胺丁醇(41.51%,88/212)、阿米卡星(21.70%,46/212)、对氨基水杨酸(35.85%,76/212)、对氨基水杨酸异烟肼(52.83%,112/212)、卷曲霉素(28.77%,61/212)],差异均有统计学意义(χ~2值分别为16.721、46.987、10.628、6.793、10.930、7.986、16.370,P值均<0.05)。(3)logistic回归分析显示耐药的药品数目>7个[OR(95%CI)=9.328(2.058~42.290)]是克拉霉素耐药的危险因素。结论耐药肺结核患者克拉霉素的耐药率低于其他常用抗结核药物,多发生在耐多药/广泛耐药患者,耐药的药品数目>7个是患者对克拉霉素产生耐药的主要危险因素。

IFN-γ和IL-10作为药物抗结核活性评价指标的可行性考察

目的探讨细胞因子是否可以作为一项指标评价药物对小鼠结核模型的疗效。方法 75只BALB/c小鼠雾化感染建立小鼠结核模型,分为13组,药物治疗2月以后,取血并做全肺活菌(CFU)计数;ELISA法检测血清中的γ-干扰素(IFN-γ)和白介素10(IL-10)的浓度;以全肺活菌计数作为药物对小鼠结核活性的标准,检验血中的γ-干扰素和白介素10的含量及二者的比值与小鼠肺中全肺活菌的相关性并进行线性回归。结果①全肺活菌计数:除左氧氟沙星(Lfx)和对氨基水杨酸(PAS)组以外,其余各治疗组与空白对照组相比均有统计学差异;各治疗组与阳性对照组(利福平+异烟肼+吡嗪酰胺,RHZ)相比均有统计学差异。②γ-干扰素:除左氧氟沙星、对氨基水杨酸组以外的各治疗组与空白对照组均有统计学差异;各治疗组与阳性对照组相比没有统计学差异。③白介素10:各治疗组与空白对照组、各治疗组之间均没有统计学差异。④γ-干扰素/白介素10:氯法齐明、利奈唑胺+丙硫异烟胺、利奈唑胺+氯法齐明、利奈唑胺+阿米卡星、利福平+异烟肼+吡嗪酰胺组与空白对照组相比有统计学差异,各治疗组之间均没有统计学差异。⑤γ-干扰素、白介素10、γ-干扰素/白介素10与全肺活菌呈正相关,确定因子r2分别为0.688、0.237、0.582。结论外周血中γ-干扰素的含量可以用来判断治疗方案是否有效,但不适宜作为生物标记物来预测体内结核菌的数量。