小鼠脑血管平滑肌细胞和内皮细胞的联合提取与鉴定

[目的]建立一种高效且稳定的原代小鼠脑血管平滑肌细胞和内皮细胞的分离方法,为脑血管病发病机制和治疗方法的探究提供实验材料。[方法]通过葡聚糖梯度离心联合酶消化法分离脑血管平滑肌细胞,再通过免疫磁珠分选分离脑血管内皮细胞。使用倒置相差显微镜观察两种细胞的形态和生长特征,通过免疫荧光鉴定纯度,通过CCK-8法观察传代后生长和增殖特性。在细胞功能层面,通过血管形成实验评估内皮细胞血管形成能力,通过迁移实验评估平滑肌细胞对血小板源性生长因子(PDGF)的反应性。[结果]采用本方法分离出的两种细胞生长旺盛,状态良好。平滑肌细胞表现出典型的“峰谷状”生长,免疫荧光结果显示胞质内平滑肌特异性α-SMA和SM22α表达阳性;内皮细胞表现出典型的“铺路石”样生长,血小板内皮细胞黏附分子CD31和闭锁小带蛋白1表达阳性。[结论]本研究建立了一种高效同时分离两种脑血管细胞的可靠方法,分离细胞纯度高,活性良好,且传代后特征稳定,足以满足后续实验需求。

血管内膜增生和再狭窄手术模型的研究进展

科技发展颠覆了传统的生活模式,但由于良好生活习惯的缺乏,加剧了人类罹患心脑血管疾病的风险,动脉粥样硬化患者总量连年增多即是一个明显例证,也就此显著提高了临床血管成形术介入治疗的需求量。传统治疗方案存在较高的术后再狭窄可能性,因此明确再狭窄发生的机制对再狭窄的防治具有重大的意义。探索再狭窄诱因与治疗方案的前提主要在于构建可靠、安全、稳定的血管再狭窄动物模型。目前,内膜增生和再狭窄模型已经成熟并广泛地应用于模拟血管成形术后血管再狭窄的情况。内膜增生的动物模型可采用多种方式致动脉损伤,如球囊导管、导丝、结扎和套环等。这些方法均可以造成动脉内膜增生,继而导致血管狭窄。本文将结合各种建模方法的特点概述各种方法的优缺点,以求寻找一种实用性最强的建模方法,供实验性血管疾病研究参考。

程序性细胞死亡相关途径调控血管钙化

血管钙化具有年龄依赖性,与心血管全因死亡率密切相关。目前越来越多的证据表明新型程序性细胞死亡方式包括铁死亡、焦亡、自噬等在血管钙化发生过程中起重要作用。该综述介绍了细胞程序性死亡的分子机制及其与血管钙化间的相互关系,阐述了通过调控细胞死亡途径关键分子抗血管钙化的证据。

GPX4相关的中枢神经系统疾病及其治疗进展

中枢神经系统(CNS)是人体神经系统的主体部分,是人体中结构和功能最精细、最复杂的系统。正因CNS的结构基础而造成了CNS疾病的多样化,发病机制深奥且复杂。构成CNS的基本单位是神经细胞,其受到损伤甚至死亡是许多CNS疾病发病的根本机制。铁死亡是近年来发现的一种细胞死亡途径,神经细胞的铁死亡在较多CNS疾病的发病过程中发挥重要作用。谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)作为铁死亡调节通路中的关键酶更是成为了许多CNS疾病治疗研究的重要靶点。因此,本文着重阐述铁死亡中GPX4调节的关键机制,以及近年来与GPX4相关的CNS疾病治疗的研究进展,希望为今后CNS疾病治疗的相关研究提供方向。

E-钙黏蛋白在鼻咽癌中表达的意义及研究进展

E-钙黏蛋白(E-cad)是钙黏蛋白超家族的一员,是由CDH1基因编码的Ⅰ型跨膜蛋白,广泛存在于人和动物全身上皮细胞的细胞黏附分子和肿瘤抑制因子,介导上皮细胞间的黏着连接,对胚胎发育时的细胞识别、迁移和组织分化也有重要作用。研究证实,E-cad水平的下降能够促进癌细胞扩散、转移。在缺乏E-cad的癌细胞中,再表达E-cad或者通过其他方式提高E-cad的表达水平可以抑制肿瘤的侵袭。鼻咽癌是我国高发恶性肿瘤之一,调高E-cad的表达水平不仅可以抑制鼻咽癌细胞的侵袭能力及迁移能力,还可以解决鼻咽癌细胞耐药性和耐辐射性的问题。本文就E-cad在鼻咽癌中表达的意义及研究进展进行综述。

PCBP1相关生物功能的研究进展

Poly(rC)-结合蛋白[poly(C)-binding proteins,PCBPs]具有高度亲和力,以及与多聚胞嘧啶结合的特殊序列。PCBPs在哺乳动物细胞中广泛表达,其包含4种亚型:PCBP1-4。在真核细胞中,PCBP1通过与基因启动子的特殊位点结合来发挥信号依赖与协调转录调控作用。PCBPs功能多样,通过酵母双杂交研究发现PCBP1在蛋白-RNA,蛋白-蛋白相互作用的层面更是参与多个功能环路,发挥了多种胞内作用。目前PCBP1在各个系统肿瘤,病毒感染,铁离子的转运等方面成为研究热点。本文就PCBP1的重要生物学功能进行相关综述。

Ⅱ型神经纤维瘤病的基础临床研究进展

Ⅱ型神经纤维瘤病(NF2)是一种常染色体显性遗传病,典型症状包括耳鸣、耳聋、眩晕、面瘫。NF2发病机制十分复杂,目前尚未阐明。研究表明NF2的发生与NF2基因突变、表观遗传修饰和细胞通路异常调控等因素有关。现有的NF2检查手段如核磁共振成像、听力检测、基因检测等都存在一定缺陷。在治疗方面,手术、放疗和药物治疗的效果欠佳,有待进一步提升。同时,随着技术的成熟,基因治疗有望成为新的治疗手段。本文对NF2的临床表现、发病机制、检查和治疗手段相关进展进行了回顾总结,以期能够为NF2的机制和治疗研究提供新的思路。

PCBP1对神经毒素6-OHDA诱导的小胶质细胞凋亡的影响

目的观察PCBP1对于神经毒素6-OHDA所介导小胶质细胞BV-2的细胞凋亡的影响.方法将空载质粒pEGFP-N1与PCBP1构建重组质粒,经酶切、纯化、测序鉴定,采用脂质体转染法将PCBP1基因转入小胶质细胞BV-2细胞系24h时,用不同浓度6-OHDA于不同时间分别刺激BV-2细胞,采用流式细胞仪对细胞周期进行检测.结果经测序鉴定显示成功构建PCBP1的真核表达载体.流式细胞仪检测:同等剂量6-OHDA对转染pEGFP-N1-PCBP1(实验组)和pEGFP-N1(对照组)的BV-2细胞作用不同时间后,实验组细胞的早期凋亡率较对照组明显减少,差异有统计学意义(P<0.05),而两组晚期凋亡率比较,差异无统计学意义(P>0.05);不同剂量的6-OHDA对两组细胞作用24h后,实验组较对照组的细胞早期凋亡率明显减少,差异有统计学意义(P<0.05),而两组晚期凋亡率比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论 PCBP1对6-OHDA所介导的细胞早期凋亡率有一定的影响,有利于PCBP1在帕金森病中进一步研究.

PCBP1对6-OHDA作用的HA细胞生长状况的影响

目的探讨核不均一核糖核蛋白(PCBP1)基因对6-OHDA作用的人星形胶质细胞系HA细胞生长状态的影响。方法利用亚克隆方法构建pEGFP/N1-PCBP1重组质粒,经酶切以及DNA测序鉴定,脂质体转染HA细胞24h后,采用不同浓度6-OHDA刺激HA细胞72h。细胞计数及CCK8法绘制细胞生长曲线了解细胞增殖情况,倒置显微镜下观察细胞生长状态。结果5、10μmol/L 6-OHDA作用下,转染PCBP1的HA细胞(实验组)较转染对照质粒的HA细胞(对照组)增殖加速(P<0.05);20、30μmol/L 6-OHDA作用下,实验组和对照组的细胞增殖情况比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论体外实验初步证明PCBP1对低浓度6-OHDA作用的HA细胞的生长有一定促进,对神经毒素有明显的抵抗作用。

PCBP1对6-OHDA作用的SH-SY5Y细胞凋亡影响的研究

研究核不均一核糖核蛋白(PCBP1)对6-OHDA作用的神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞凋亡的影响。方法:构建含PCBP1的真核表达载体pEGFP/N1-PCBP1,转染SH-SY5Y细胞,用不同浓度6-OHDA对转染后SH-SY5Y细胞刺激不同时间后,流式细胞仪检测分析细胞凋亡率。结果:不同浓度的6-OHDA对转染PCBP1重组质粒的实验组和转染空质粒的对照组细胞作用24h后,实验组细胞早期凋亡率低于对照组细胞,差异有统计学意义(P<0.05);但实验组和对照组细胞晚期凋亡率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。另外,25μmol/L6-OHDA分别对实验组和对照组细胞作用不同时间后,同样,实验组细胞早期凋亡率低于对照组细胞,差异有统计学意义(P<0.05);该浓度6-OHDA作用不同时间后,实验组和对照组细胞晚期凋亡率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:过表达PCBP1基因可抵抗6-OHDA对SH-SY5Y细胞的早期凋亡作用,降低细胞凋亡率。

基于一个伴发脑血管狭窄的NF1家系的点突变小鼠建模

目的利用CRISPR/Cas9技术构建Nf1基因Q181X定点突变的小鼠模型,为研究该点突变与脑血管狭窄的关系提供实验工具。方法根据Nf1基因点突变的位置和基因组结构设计针对Nf1基因Q181X位点的g RNA,经活性检测后,将有活性的gRNA、Cas9 mRNA以及含有点突变序列的donor DNA通过显微注射到小鼠受精卵中,并移植至假孕鼠体内。获得F0代小鼠后,通过PCR和基因测序技术对Nf1基因进行检测和鉴定。对所获的F0代基因突变阳性小鼠继续繁育后获得F1、F2代目标基因阳性小鼠。结果成功构建Nf1-Q181X基因点突变F0代杂合型小鼠3只,F1代杂合型小鼠2只,F2代杂合小鼠6只,经PCR及基因测序鉴定可稳定遗传Nf1-Q181X点突变。结论 H通过CRISPR/Cas9技术成功获得Nf1基因Q181X点突变小鼠模型,为研究该特定点突变与脑血管异常的关系提供了实验工具。

Ⅰ型神经纤维瘤病血管病变发病机制研究进展

Ⅰ型神经纤维瘤病(neurofibromatosis type 1,NF1),也称Von Recklinghausen病,是一种常见的多系统遗传病,累及包括皮肤、中枢及周围神经系统、骨骼、脉管系统及内分泌系统等多个系统。其发病基因为Nf1,属于抑癌基因,定位于17q11.2,其编码的神经纤维瘤蛋白是Ras通路的重要抑制因子,调控多种细胞的增殖与分化。尽管血管病变较皮肤神经纤维瘤等典型症状少见,但会导致血管的狭窄、阻塞、动脉瘤等,甚至引起血管破裂,是导致NF1患者青少年人群过早病死的主要原因,严重影响NF1患者的预后。NF1相关血管病变发病机制十分复杂,包括血管生长因子分泌的增加、炎性细胞的参与等,近年来对其机制的深入研究也为其治疗带来新的突破。本文就NF1相关血管病变机制的研究进展进行综述。

Nf1基因沉默促进人脑血管内皮细胞的增殖

目的抑制1型神经纤维瘤病(NF1)发病基因Nf1在人脑血管内皮细胞(HBMECs)中的表达并检测HBMECs增殖改变情况,以研究NF1相关脑血管病发病机制。方法设计并合成3对Nf1基因小干扰RNA(siRNA)及其阴性对照;使用脂质体转染法将siRNA转染进HBMECs,通过实时荧光定量PCR(Real-time PCR)及Western blot法分别检测Nf1基因mRNA和蛋白质表达情况。将筛选出的具有最佳Nf1基因沉默效应的siRNA转染进HBMECs,并设置阴性对照,使用细胞计数试剂盒8(CCK8)法与细胞计数法检测细胞增殖情况。结果3对siRNA均具有一定的Nf1基因沉默效应,其中siRNA C基因沉默效应最佳,Nf1基因mRNA相对转录水平是对照组的(58.65±0.62)%,神经纤维瘤蛋白(neurofibromin)的相对表达量为对照组的(29.447.10)%,差异均有统计学意义(P<0.01)。CCK8法与细胞计数法结果均显示Nf1基因沉默后HBMECs 5d中有4d实验组相对细胞数多于对照组(P<0.05)。结论干扰HBMECs Nf1基因后,其增殖活性增强,这可能是NF1相关脑血管病的发病机制之一。

PCBP1在神经发育和神经系统疾病中的作用

Poly(rC)结合蛋白1[poly(rC)-binding protein 1,PCBP1]是一种相对分子质量为38000的RNA或DNA结合蛋白。众所周知,PCBP1通过其特有的KH结构,参与了细胞内的转录和转录后调控,包括选择性的pre-mRNA剪接、mRNA稳定性和翻译。PCBP1不仅在促进神经干细胞的增殖和调控轴突导向相关基因的表达中至关重要,而且可以调节疾病相关基因的表达来影响神经退行性疾病的病理生理过程,调控细胞增殖和转移基因影响神经肿瘤细胞的行为,影响炎症细胞的活化和炎症反应的程度,以此参与多种神经疾病的发病机制。综上所述,深入研究PCBP1的功能可以帮助我们更好地理解其分子机制,并为神经系统疾病的治疗提供新的思路。