人鼻咽癌顺铂耐药细胞系(CNE2/DDP)的建立及耐药相关基因的筛选

背景与目的:化疗是鼻咽癌最主要的辅助治疗手段,然而癌细胞耐药性的产生常常导致药物治疗的失败,因此,筛查鼻咽癌耐药相关基因、寻找逆转药物耐受的分子靶点具有重要的现实意义。本研究首先用鼻咽癌药物敏感细胞CNE2作为亲本细胞诱导建立耐药细胞系,并在此基础上,筛选鼻咽癌耐药相关基因,探讨耐药性产生的分子机制。方法:以顺铂(cisplatin,DDP)为诱导剂,采用大剂量冲击与剂量逐渐递加相结合的方法,诱导建立人鼻咽癌耐药细胞系CNE2/DDP。采用MTT法测定药物的敏感性、流式细胞术测定细胞周期及细胞内荧光药物罗丹明的蓄积,并进行细胞生长曲线测绘、倍增时间测定及细胞形态学观察。随后,采用基于PCR技术改良的消减杂交法筛选并克隆耐药相关基因。反向点杂交鉴定排除假阳性,DNA测序分析差异表达片段,RT-PCR对差异表达的基因片段做进一步验证。结果:所建立的人鼻咽癌耐药细胞系CNE2/DDP对DDP的耐药指数为27.9,对5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)及长春新碱(vincristine,VCR)的耐药指数分别可达227.9和55.5,表明其具有多药耐药的特征。流式细胞测定显示耐药细胞内罗丹明的蓄积明显低于敏感细胞(12.98vs.243.62)。镜下观察耐药细胞体积变小,形态变圆,细胞倍增时间明显延长(26hvs.19h)。

人鼻咽癌顺铂耐药细胞系(CNE2/DDP)及其亲代细胞(CNE2)的比较基因组杂交研究

背景与目的:比较基因组杂交(comparativegenomichybridization,CGH)是一种在荧光原位杂交(FISH)技术上发展起来的,用于检测两个基因组间相对DNA拷贝数的改变(缺失或扩增),并将这些变化在染色体上进行定位的分子细胞遗传学方法。为全面了解鼻咽癌耐药细胞与药物敏感细胞在基因组DNA水平上可能存在的差异,以及这种差异在肿瘤耐药性产生中的意义,我们用CGH技术对鼻咽癌耐药细胞系(CNE2/DDP)和其亲代药物敏感细胞(CNE2)的基因组DNA进行检测和分析。方法:提取两种癌细胞及正常胎盘组织的基因组DNA,以随机引物法进行荧光标记(CNE2/DDP和CNE2DNA以Fluorescein-12-dUTP标记,探针显绿色荧光;正常胎盘组织以Tetramethylrhodamine-5-dUTP标记,探针显红色荧光),将标记的DNA探针同时与正常淋巴细胞分裂中期染色体进行杂交,杂交信号在荧光显微镜下经CCD(chargecoupleddevice)摄像装置摄取,并通过荧光数字图像分析系统(quipsCGHprogram)进行数据处理,计算两种荧光的比率并绘制分析图。结果:CNE2细胞存在广泛的染色体改变,主要表现在1q,3q,5p,6p,7p,8q,9q,11p,12q,19q的扩增和4q,12p,13p,14p,15p,18,20q,21p,22的缺失。从CNE2诱导的耐药细胞系CNE2/DDP恒定表现为8q,19q的扩增和8p的缺失,其它的染色体均未发现明显异常的?

免疫组化方法检测肿瘤标志在肺癌组织芯片中表达的可靠性研究

目的 用免疫组化方法检测肺癌组织芯片肿瘤标志的可靠性和有效性进行了探讨。方法 建立含有 4 18例非小细胞肺癌标本的组织芯片 ,并随机选取了 5 0例与组织芯片标本相对应的全组织标本。用免疫组化方法研究并对比了Ki 6 7和p5 3在组织芯片和全组织标本中的表达情况及其符合程度和可靠性。结果 组织芯片和全组织切片中Ki 6 7和 p5 3表达的一致率分别为 98%和 96 %。非小细胞肺癌三位点组织芯片检测Ki 6 7和p5 3表达的可靠性好 ,Kappa值分别为0 .95和 0 .91。结论 三位点组织芯片可有效、可靠地检测肿瘤标志物在非小细胞肺癌中的表达。本研究表明组织芯片技术特别适用于大样本。

恶性肿瘤治疗的新策略——基因-病毒治疗

本文较系统地介绍了几种增殖病毒治疗肿瘤的最近进展 ,目前最为有效的增殖病毒是ONYX 015 ,它与常规化疗联合 ,可产生令人鼓舞的临床疗效。但单独应用 ,其病毒杀伤力仍不足 ,从而提出了一种新型的肿瘤治疗新策略 ,即基因 病毒治疗法 ,该方案充分利用增殖病毒及基因治疗的优势 ,它可能成为肿瘤治疗最有效的方案之一。

棉籽酚诱导结肠癌细胞系凋亡的作用

研究棉籽酚gossypol对结肠癌细胞的致凋亡作用及其方式。方法 :将不同浓度棉籽酚与结肠癌细胞株HT2 9和Lovo作用 ,采用集落形成法检测细胞经棉籽酚处理后的细胞存活曲线 ,通过荧光显微镜观察用药后细胞周期时相改变。结果 :HT2 9和Lovo经棉籽酚处理后增殖能力降低 ,2种细胞均显示明显凋亡征象 ,表现典型DNA梯 ,2种细胞均于用药后 2 4与 48h出现凋亡峰 (亚G1峰 ) ,并随药物浓度和用药时间增加而增加。细胞周期分布无明显变化。结论 :棉籽酚在体外能诱导结肠癌细胞发生G1期凋亡 ,抑制细胞增殖 ,是一种具有潜在抗肿瘤作用的化疗药 。

用组织微阵列技术分析鼻咽癌变多阶段组织细胞周期蛋白D_1过表达

为了探讨细胞周期蛋白D1(CyclinD1)在鼻咽癌变多阶段病变组织中的蛋白质表达与鼻咽癌变的关系 ,应用组织微阵列 (tissuemicroarray)技术 ,采用免疫组化方法检测CyclinD1在鼻咽癌旁粘膜上皮单纯性增生 /化生 (simplehyperplasia/metaplasia ,SH/SM )、异型增生 /化生 (atypicalhyperplasia/metaplasia,AH/AM )和鼻咽癌 (nasopharyngealcarcinoma,NPC)的蛋白质表达 ,阳性表达率分别为 30 0 % (3/ 10 )、 90 0 % (18/ 2 0 )和6 2 9% (39/ 6 2 ) ,其中在异型增生 /化生中呈“一过性增高” .表明CyclinD1高表达可能为鼻咽癌发生过程中的早期事件 ;异型增生 /化生可能是鼻咽癌变的重要“关卡” .

卵巢癌紫杉醇耐药细胞株OC_3/TAX_(300)建立及基因表达谱分析

目的：建立人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株,探讨其基因表达谱差异与紫杉醇耐药之间相关性。方法：采用反复大剂量紫杉醇冲击法,由亲本细胞OC_3建立卵巢癌紫杉醇耐药细胞株OC_3/TAX_(300)。运用比较基因组杂交(comparative genomic hy- bridization,CGH)及基因芯片技术分析耐药及敏感株细胞染色体DNA拷贝数和基因表达谱差异。结果：OC_3/TAX_(300)耐药株历时10个月建成,耐药性稳定,耐药指数为6.70。CGH结果显示OC_3/TAX_(300)细胞染色体2p22的高水平扩增。基因表达谱芯片共筛选出显著表达差异基因134条,其中117种基因表达水平下调,17种基因表达上调,有代表性的下调基因为KCNK2、COP9,上调的基因为JAK2。结论：建立卵巢癌紫杉醇耐药细胞株OC_3/TAX_(300),耐药性稳定,可以作为筛选耐药基因和耐药逆转剂的细胞模型。OC_3/TAX_(300)细胞染色体2p22的高度扩增、KCNK2、COP9基因下调和JAK2基因上调与卵巢癌化疗耐药有关。

组织芯片技术研究肝脏良恶性病变细胞增殖活性和微血管密度的差异

目的 :研究肝脏良恶性病变中细胞增殖活性和微血管密度表达强度与数量的差异性 ,进一步揭示肿瘤的生物学特征。 方法 :选取肝细胞癌 2 90例、肝硬化 12 8例与肝良性病变 (包括肝细胞腺瘤和肝细胞局灶性结节增生 ) 2 5例 ,应用组织芯片技术和免疫组化方法研究细胞核增殖抗原 (PCNA)、Ki- 6 7和微血管密度 (MVD)在肝脏良恶性病变中的表达强度与数量。结果 :PCNA、Ki- 6 7在肝细胞癌组阳性率分别为 90 .2 %和 4 3.1% ,在肝硬化组为 4 8.5 %和 3.9% ,组间差异有高度显著性(P<0 .0 1) ,而良性病变组无 1例阳性 ;MVD在肝细胞癌组为 2 2 .7± 15 .8,显著高于肝硬化组 (8.3± 7.6 ) ,差异有高度显著性(P<0 .0 1) ,而与良性病变组 (31.3± 2 2 .7)无差异 (P>0 .0 5 )。肝细胞癌病理 - 级 MVD(2 9.9± 18.6 )显著高于病理 级和 级 (2 2 .2± 18.2、2 2 .9± 19.0 ,P<0 .0 1)。结论 :细胞高增殖状态与多量的新生血管是恶性肿瘤的重要特征 ,PCNA、Ki- 6

鼻咽癌转移相关基因的比较基因组杂交和cDNA微阵列研究

为筛选在鼻咽癌转移中起重要作用的基因 ,应用比较基因组杂交 (CGH)和cDNA微阵列方法研究成瘤和转移能力不同的鼻咽癌细胞株 6 10B和 5 8F .CGH结果显示 ,2种细胞株在 5p、7q、8p、9q、11p、12q和 17p的一定区域存在差异性扩增 ,在 2q存在差异性缺失 ;cDNA微阵列显示 ,相对于非转移性 6 10B细胞株 ,高转移性 5 8F细胞表现一些基因表达的上调及下调 。

染色体2p22的过度扩增及hmsh2基因的高表达与卵巢癌紫杉醇耐药相关性的研究

目的研究染色体特定区域DNA拷贝改变、基因差异表达及其与紫杉醇耐药的关系。方法运用比较基因组杂交(comparativegenomichybridization,CGH)及RTPCR技术,分析卵巢癌紫杉醇耐药株染色体基因组变化和hmsh2基因在卵巢癌组织中的表达。结果CGH结果显示最有意义的变化是卵巢癌紫杉醇耐药株OC3/Tax300细胞染色体2p22过度扩增。RTPCR检测发现hmsh2基因在OC3/Tax300细胞高度表达。hmsh2基因表达阳性率在组1和组2分别为93.9%(31/33)及47.6%(10/21),差异有显著性;在低分化癌为93.3%,显著高于中、高分化癌的54.2%。结论2p22拷贝数的过度扩增及hmsh2基因的高度表达可能与卵巢癌紫杉醇耐药相关。

ALC1蛋白在食管鳞癌中的表达及其对细胞增殖侵袭迁移的影响

目的:探讨ALC1(amplified in liver cancer 1)在食管鳞癌组织中的表达及与临床病理特征及总生存率关系,检测过表达ALC1基因对食管癌细胞恶性生物学行为的影响。方法:采用免疫组织化学方法检测245例食管鳞癌组织及癌旁组织中ALC1蛋白的表达,并探讨其与食管鳞癌患者性别、年龄、分化程度、浸润深度、TNM分期、远处淋巴结转移关系及总生存率关系;采用MTT法、克隆形成实验、Transwell实验及细胞划痕实验等观察高表达ALC1基因在食管癌细胞中的增殖、侵袭及迁移作用。结果:ALC1蛋白在食管癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织(41.6%vs.21.2%,P<0.05);ALC1的高表达与肿瘤的浸润深度、TNM分期和淋巴结转移明显相关(P<0.05)。ALC1高表达的食管鳞癌患者总生存率低。ALC1基因能够促进KYSE30食管癌细胞过度增殖、侵袭和迁移。结论:ALC1表达升高可能与食管鳞癌的发生、发展相关,导致总生存率下降,高表达的ALC1基因增强KYSE30食管癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力,检测ALC1可能为食管癌预后判断提供依据。

食管鳞癌组织中抑癌基因SEMA3B的表达及意义

目的探讨抑癌基因信号素3B(SEMA3B)在食管鳞癌(ESCC)发生、发展中的作用。方法采用RT-PCR法检测51例食管鳞癌组织(观察组)及相应正常食管组织(对照组)中SEMA3B基因的表达,并分析其与食管鳞癌临床病理参数的关系。结果对照组SEMA3B基因均表达,观察组SEMA3B基因表达缺失率为58.8%(30/51,P<0.05);SEMA3B基因表达与食管鳞癌组织发生部位、淋巴结转移和临床病理分期有关,而与年龄、性别、肿瘤细胞分化程度和大体分型无关。结论SEMA3B基因的表达异常可能在食管鳞癌的发生、发展及预后中起重要作用;SEMA3B可作为反映食管鳞癌生物学行为的指标之一。

卵巢癌紫杉醇耐药细胞株OC_3/PIX_3及OC_3/PIX_5的比较基因组杂交研究

目的:了解两种卵巢癌紫杉醇耐药株(OC3/PIX3及OC3/PIX5)和其亲代细胞紫杉醇敏感株(OC3)染色体DNA拷贝数的差异变化,探讨耐药细胞的分子遗传学改变。方法:运用比较基因组杂交(comparative genom ic hybrid ization,CGH)技术,将OC3/PIX3及OC3/PIX5与其亲代细胞株OC3的染色体基因组进行比较分析。结果:3种细胞株的染色体2pter-p21、3q、5p、9均有遗传物质表达增加;10号染色体表达增加仅见于OC3。染色体1,4,6的遗传物质在3种细胞株的表达均有减少。3p的减少发生在OC3和OC3/PIX5。仅在OC3细胞中见到7q、8p减少。OC3和OC3/PIX5出现染色体10q22过度扩增。最有意义的变化是OC3/PIX3细胞染色体2p22的过度扩增。结论:2p22拷贝数过度扩增可能与卵巢癌紫杉醇耐药相关。

比较基因组杂交技术:贲门癌和淋巴结转移灶的染色体变化特征

目的:探测河南食管贲门癌高发区居民贲门癌及其淋巴结转移灶中染色体基因组的变化特征,为进一步筛选与贲门癌变和淋巴结转移相关基因提供理论依据和范围. 方法:应用比较基因组杂交技术(comparative genomic hybridization,CGH)来分析原发性贲门癌患者30例及其相应淋巴结转移灶7例中染色体基因组的变化. 结果:在贲门癌30个样本中总共有126增加和117丢失:每例患者平均DNA拷贝数的增加和丢失分别为4.2 和3.9.染色体基因组增加频率最高的是20q(43%),其次为6q(40%),8q(37%),7p(27%),6p(33%),7q(33%), 1q(30%),13q(23%),11q(20%)和5p(20%).染色体基因组丢失频率最高的是17p(57%),其他为19q(50%), 1p(47%),3p(30%)和4p(20%).在贲门癌淋巴结转移灶7例中,总共有75增加和58个丢失,平均DNA 拷贝数的增加和丢失分别为10.7和8.3.染色体增加为8q(5/7),20(4/7)和1q,2p,3q,6,7,11P11- q13,11q14-q23,13(均为3/7),染色体的丢失为9p13-qter(4/7),4(3/7)和1pter-1q33,7p12-qter, 16p,17p,18(均为2/7). 结论:20q,6q,8q,7p,6p,7q,1q,13q,11q, 5p的染色体基因组增加和17p,19q,1P,3p,4p 的丢失与贲门癌相关,而8q,20的增加和9p13-qter, 4Pq的丢失可能与贲门癌的淋巴结转移相关.

基因-病毒治疗系统CNHK200-hA对肺癌治疗的研究

目的 构建抗肿瘤新生血管生成的基因治疗与病毒治疗相结合的基因 病毒治疗系统CNHK2 0 0 hA ,并对其肺癌的体内外治疗作用进行初步研究。方法 通过Westernblot分析 ,观察携带抗肿瘤新生血管生成基因angiostatink1 5 (hA)的基因 病毒治疗系统CNHK2 0 0 hA和非增殖型腺病毒对介导k1 5蛋白表达的影响 ;通过细胞病理作用及动物试验 ,比较CNHK2 0 0 hA和非增殖型腺病毒对人肺癌细胞株A5 4 9的杀伤作用及对肺癌裸鼠移植瘤的治疗作用。结果 基因 病毒治疗系统CNHK2 0 0 hA能够介导hA基因在肺癌细胞内高效表达k1 5蛋白 ,其表达量高于非增殖型腺病毒Ad hA。细胞病理效应显示 ,CNHK2 0 0 hA对A5 4 9的杀伤作用明显优于Ad hA ,CNHK2 0 0 hA在感染复数 (MOI)值为 1时可完全杀伤A5 4 9细胞 ,而达到相同杀伤效应的Ad hA的MOI值为 1 0 0。动物试验显示 ,CNHK2 0 0 hA对肺癌的疗效明显好于Ad hA及肿瘤增殖型病毒ONYX 0 1 5。结论 插入了抗肿瘤新生血管生成基因hA的基因 病毒治疗系统CNHK2 0 0 hA ,可明显提高hA基因的表达量 ,其在体内外的抗肺癌作用较非增殖型腺病毒Ad hA及肿瘤增殖型病毒ONYX 0 1 5进一步提高。

非小细胞肺癌组织中上皮钙黏蛋白的表达及与预后的关系

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)组织中上皮钙黏蛋白(Ecadherin)的表达及与预后的关系。方法用组织阵列仪构建365例NSCLC患者手术切除癌组织标本的组织芯片,对该芯片进行Ecadherin免疫组化染色,并分析Ecadherin表达与临床病理资料及生存预后的关系。365例中,鳞癌116例、腺癌199例、腺鳞癌等组织类型50例。结果Ecadherin蛋白主要在肿瘤细胞的胞膜和细胞质中表达,有32.1%(117/365)为Ecadherin低表达。Ecadherin低表达与淋巴结转移(χ2=16.430,P=0.001)、肿瘤细胞低分化(χ2=9.243,P=0.010)以及临床病理分期(χ2=9.421,P=0.024)呈正相关,而与病理类型无明显关系;Ecadherin表达与NSCLC预后差密切相关(P<0.0001)。多因素生存分析表明,Ecadherin表达是NSCLC预后差的独立预后因素(P<0.001)。结论Ecadherin可能与NSCLC的进展有关,其表达状态是NSCLC独立预后因素。

基因-病毒载体的研制及其抗肿瘤作用的初步研究

目的 研究一种结合肿瘤基因治疗与病毒治疗优势的新型肿瘤治疗载体系统 ,即基因 病毒载体系统。方法 利用病毒重组技术将抗癌基因插入肿瘤细胞特异性的增殖病毒的病毒基因组中 ,通过细胞病理作用、荧光显微镜、免疫酶链技术及电镜等技术分别观察病毒的杀伤效应、报告基因绿色荧光蛋白、抗癌基因小鼠白细胞介素 12表达量及病毒复制情况。结果 构建了一种新型基因 病毒载体系统 ,该载体系统腺病毒E1b 5 5 0 0 0蛋白缺失 ,保留了腺病毒E1a蛋白。该载体系统具有肿瘤增殖病毒ONYX 0 15的相似功能 ,即它可在肿瘤细胞内复制及增殖 ,而在正常细胞内不能复制及增殖 ,从而特异性杀灭肿瘤细胞。该载体系统还可携带各种抗癌基因以进一步提高抗肿瘤的疗效。应用该载体系统携带该报告基因绿色荧光蛋白可使绿色荧光蛋白在肿瘤细胞内高效表达 ,其表达量明显高于传统基因治疗的腺病毒载体系 ,而在正常细胞内低表达 ,表达量与传统腺病毒载体系统相似或更低。应用该载体系统携带抗癌基因小鼠白细胞介素 12 ,也产生类似结果。电镜也证实该载体系统携带抗癌基因小鼠白细胞介素 12可在肿瘤细胞株中复制及增殖。结论 基因 病毒载体将抗癌基因插入肿瘤增殖病毒基因组 ,可数百倍乃至上万倍提高抗癌基因的表达量 。

基因-病毒治疗系统CNHK200-hA的构建及体外初步研究

目的 构建一种结合抗肿瘤新生血管生成的基因治疗与病毒治疗优势的新型肿瘤基因 病毒治疗系统CNHK2 0 0 hA。方法 克隆人抗血管生成基因Angiostatin(k1 5 ) ,命名为hA。利用病毒重组技术将hA插入肿瘤特异性增殖病毒的病毒基因组中 ,通过病毒增殖试验、电镜技术、Westernblot分析、鸡胚尿囊膜试验 (CAM ) ,观察CNHK2 0 0 hA的复制情况、hA基因的表达及其对新生血管生成的抑制作用。结果 构建了一种新型的基因 病毒治疗系统CNHK2 0 0 hA。该治疗系统为E1b 5 5× 10 3 蛋白缺失而保留了腺病毒E1a蛋白的 5型腺病毒 ,能在肿瘤细胞内大量增殖及复制 ,而在正常细胞内增殖能力较弱 ,从而特异性杀灭肿瘤细胞。同时CNHK 2 0 0 hA携带人抗肿瘤新生血管生成基因hA ,能在肿瘤细胞内高效表达hA蛋白 ,其表达量高于传统基因治疗的腺病毒载体系统。电镜证实该治疗系统可在肺癌A5 49细胞株中复制及增殖。CAM试验证实该治疗系统感染肺癌细胞后的培养液上清具有抗新生血管生成的生物活性。结论 基因 病毒治疗系统CNHK2 0 0 hA能在肿瘤细胞中增殖复制 ,并明显提高hA基因的表达量 ,表达产物具有抑制新生血管形成的作用。