果蝇TRP离子通道C端一个新钙调蛋白结合位点的鉴定和分析

瞬时受体电位（TRP）通道是一类钙离子透过性的阳离子通道蛋白家族,参与了视觉、味觉、温度感受等重要的生物学过程。之前的研究表明,钙离子既能够正反馈也能够负反馈地调节瞬时受体电位通道的活性,而这种调节可能是通过钙调蛋白（calmodulin,CaM）与TRP通道的相互作用来进行的。为了阐明这一调控机制,我们首先需要对钙调蛋白与瞬时受体电位通道之间的相互作用进行详细的生化研究。在此项研究中,通过大肠杆菌表达系统,表达和纯化了果蝇瞬时受体电位通道羧基末端不同长短的蛋白片段,并发现了一个新的钙调蛋白结合位点。通过快速蛋白液相色谱、静态光散射以及等温量热滴定技术,鉴定了这一钙调蛋白结合位点与果蝇瞬时受体电位通道之间的相互作用,发现它们在钙离子依赖的条件下,可以形成亲和力非常强的稳定的蛋白复合物（解离常数在0.1~1微摩尔范围）。此外,通过合成多肽的方法,鉴定了果蝇瞬时受体电位通道913~939片段为该钙调蛋白结合位点的核心区域。最后,通过突变实验,进一步明确了果蝇瞬时受体电位通道922位的酪氨酸以及923位的缬氨酸为其钙调蛋白结合位点的关键氨基酸。总而言之,本研究发现和鉴定了果蝇瞬时受体电位通道上一个新的钙依赖的钙调蛋白结合位点,这一发现将为研究瞬时受体电位通道的体内功能提供生化基础,为阐明钙离子通过钙调蛋白调节瞬时受体电位通道的分子机制做出贡献。

大鼠MUPP1蛋白PDZ8结构域的生化及晶体结构特性（英文）

多重PDZ结构域蛋白1型(MUPP1)是一种存在于上皮细胞和神经细胞内含有13个PDZ结构域的重要支架蛋白.在上皮细胞中,MUPP1蛋白在紧密连接结构的形成和上皮细胞的极化过程中发挥重要作用.而在中枢神经系统中,MUPP1基因的1个提前终止突变导致了其最后12个PDZ结构域的缺失,以及严重的先天性脑积水.此外,MUPP1蛋白的表达水平与酒精依赖性和药物戒断的严重性也具有显著的相关性.因此,对MUPP1蛋白所含的PDZ结构域进行纯化和性质鉴定,将有助于深入研究MUPP1蛋白的功能和分子机制.在本文研究中,利用亲和纯化和分子筛技术,对大鼠来源的MUPP1蛋白的第8个PDZ结构域进行了表达和纯化.多角度激光光散射的数据表明:MUPP1-PDZ8结构域在溶液中为单体,分子量为16.4 k D.圆二色谱结果表明,MUPP1-PDZ8结构域具有较好的二级结构折叠,测得其熔解温度为71.6摄氏度,暗示该PDZ结构域在溶液中非常稳定.最后,MUPP1-PDZ8结构域的晶体结构显示,该结构域属于I型PDZ结构域,包含3个α螺旋和6个β折叠.其中GLGL模块、β折叠B上的1 351位亮氨酸,以及α螺旋B上的1 405位异亮氨酸/1 398位组氨酸形成的PDZ结合口袋,可以特异性地与其目标蛋白质的羧基末端相结合.综上所述,本文的研究提供了MUPP1-PDZ8结构域的生化特性,以及该结构域与其目标蛋白质相互作用的分子机制,这将为MUPP1蛋白的功能研究提供生物化学与结构生物学的理论基础.

果蝇钙调蛋白和肌球蛋白NINAC相互作用分析

果蝇的视觉信号转导途径是已知的最快的G-蛋白偶联信号通路。这其中涉及到TＲP/TＲPL通道的开放以及钙离子的内流等一系列反应的形成。NINAC（neither inactivation nor afterpotentialC）是一种特异性存在于果蝇感光细胞中的第3类肌球蛋白（Myosin III），其在终止果蝇的视觉信号转导通路中起着非常重要的作用。NINAC蛋白具有两种亚型：一种是132 kD的蛋白亚型（p132），另一种则是174 kD的蛋白亚型（p174）。这两种不同的蛋白亚型都具有相同的激酶催化结构域（kinase domain），以及与肌球蛋白相似的马达结构域（motor domain）。但是，它们在C末端却存在着非常大的差异，这其中包括了钙调蛋白结合基序（IQ motif）。NINAC的这两种蛋白亚型在果蝇的感光细胞中的定位以及作用有很大不同，尤其是在与钙调蛋白的相互作用方面。钙调蛋白结合基序与钙调蛋白（CaM）之间的相互作用对于果蝇的视觉信号通路具有重要的意义：NINAC结合钙调蛋白能力的缺失将导致果蝇的视觉传导缺陷。本文通过蛋白共表达的方法，成功表达并纯化得到了不同版本的NINAC与钙调蛋白的蛋白复合物。静态光散射的结果表明，在Ca2 ＋存在情况下，p174蛋白可以结合2个Ca2 ＋-CaM，而p132只结合1个Ca2 ＋-CaM。通过分析型凝胶过滤以及等温量热滴定技术，进一步鉴定了p174及p132的IQ2（第2个钙调蛋白结合基序）序列与Ca2 ＋-CaM的相互作用。通过序列分析及进一步的突变实验发现，p174 IQ2中的3个疏水氨基酸（F1083，F1086和L1092）对于钙调蛋白的结合非常重要，并导致了p174与p132蛋白和Ca2 ＋-CaM结合能力的差异。本文的研究提供了NINAC与Ca2 ＋-CaM相互作用的生化机制，将为进一步在果蝇视觉信号通路中深入研究CaM是如何调节NINAC的体内功能实验打下基础。