重症肌无力单链抗体基因的制备

[目的 ]构建抗人乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体 .[方法 ]应用多聚酶链反应从抗人乙酰胆碱受体主要免疫原区抗原结合片段扩增重链和轻链可变区基因 ,并克隆到载体噬粒 pHEN2 .将含有单链抗体基因的重组噬粒转化大肠杆菌DH5α ,分离提纯重组噬粒后再经酶切、琼脂糖凝胶电泳检查以确认单链抗体基因的正确性 .[结果 ]电泳检查发现了大小分别为 3 78bp ,3 3 9bp和 762bp的重链可变区、轻链可变区和单链抗体基因 ,且位置正确 .[结论

电鳐乙酰胆碱受体的分离和纯化

[目的 ]分离和纯化具有活性的电鳐乙酰胆碱受体 .[方法 ]将电鳐电器官肌肉制成匀浆 ,细胞经裂解制备电鳐乙酰胆碱受体粗提液 .经眼镜蛇毒素偶联的Sepharose 4B层析柱亲和吸附 ,得到纯化的电鳐乙酰胆碱受体 .应用酶联免疫吸附试验检查纯化的电鳐乙酰胆碱受体与抗乙酰胆碱受体抗体的结合活性 .[结果 ]分离和纯化的电鳐乙酰胆碱受体能与抗乙酰胆碱受体抗体结合 ,且结合活性高 .[结论 ]从电鳐电器官中分离和纯化的乙酰胆碱受体活性高、特异性强 ,可作为抗原在酶联免疫吸附试验中用于检查抗乙酰胆碱受体抗体 .

抗乙酰胆碱受体单链抗体在大肠杆菌中的表达

[目的 ]使构建的抗人乙酰胆碱受体单链抗体基因在大肠杆菌中表达 .[方法 ]将含有单链抗体基因的载体 pHEN2 (含有 pelB引导肽和c myc)转化大肠杆菌HB 2 15 1,在细菌外周质中表达单链抗体 .应用鼠抗c myc单链抗体的斑点杂交试验检查细菌外周质裂解物中单链抗体的表达 .[结果 ]单链抗体表达在细菌外周质中 ,培养液上清及对照大肠杆菌外周质和培养液上清均未发现单链抗体 .[结论 ]已成功地在大肠杆菌中表达了抗人乙酰胆碱受体单链抗体 .

从TE671细胞株提取人乙酰胆碱受体

目的 ]分离提取具有活性的人乙酰胆碱受体 .[方法 ]用摇动培养瓶大量培养表达人乙酰胆碱受体的TE 671细胞株 ,细胞经裂解制备人乙酰胆碱受体提取液 .应用放射免疫测定法检测提取的人乙酰胆碱受体与抗人乙酰胆碱受体抗体的结合活性 .[结果 ]提取的人乙酰胆碱受体能与抗人乙酰胆碱受体抗体结合 ,且结合活性很高 ,含量为 1 8× 10 10 个乙酰胆碱受体分子 / 10 0 μL提取液 .[结论 ]从TE 671细胞株提取的人乙酰胆碱受体具有与相应抗体结合的功能 。

电鳐乙酰胆碱受体诱导转基因小鼠重症肌无力的机制

[目的]探讨电鳐乙酰胆碱受体诱导人免疫球蛋白转基因小鼠实验性自身免疫性重症肌无力的机制．[方法]将电鳐电器官分离并纯化的乙酰胆碱受体作为免疫原，免疫人免疫球蛋白转基因小鼠，以放射免疫方法测定小鼠血清中抗乙酰胆碱受体抗体滴度，以免疫荧光技术观察小鼠骨骼肌中抗乙酰胆碱受体抗体的结合性．[结果]小鼠血清中的抗乙酰胆碱受体抗体滴度为155～539pmol，小鼠肌肉中具有人抗乙酰胆碱受体抗体．[结论]电鳐乙酰胆碱受体刺激人免疫球蛋白转基因小鼠产生的人抗乙酰胆碱受体抗体，可与肌肉组织中的乙酰胆碱受体结合，导致肌肉收缩无力，可诱导重症肌无力．

单链抗体骨架1区在与抗原结合中的作用

[目的 ]探讨单链抗体可变区骨架 1区对抗体特异性的影响 .[方法 ]应用分子克隆技术 ,以分离自重症肌无力患者胸腺的抗原结合片段Fab 6 37为亲本 ,构建了完整序列的单链抗体ScFv 6 37以及在重链和轻链可变区骨架 1区N端各缺失 8个氨基酸的单链抗体ScFv6 37Δ8aa ,在大肠杆菌表达后 ,应用放射免疫测定法检查单链抗体与抗原 人乙酰胆碱受体的结合活性 .[结果 ]单链抗体ScFv 6 37Δ8aa不能与人乙酰胆碱受体结合 ,然而在同一试验中 ,单链抗体ScFv 6 37能高亲合性地与人乙酰胆碱受体结合 .[结论 ]单链抗体骨架 1区的结构可影响抗体与抗原表位的结合特异性 .

抗乙酰胆碱受体单链抗体的纯化

[目的 ]纯化抗乙酰胆碱受体单链抗体 ,为测定其特异性准备材料 .[方法 ]将大肠杆菌表达的单链抗体 (含有 6xHis及c myc标记肽 )经Ni nitrilotriaceticacid(Ni NTA)纯化 ,以十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳和应用鼠抗c myc单克隆抗体的免疫印迹试验鉴定纯化产物 ,并根据吸光度值测定表达产物的含量 .[结果 ]在纯化产物中发现大小约为 36KD的单链抗体 ,杂质蛋白带较少 ,表达量约为30 μg/L .[结论 ]用Ni NTA纯化带有 6xHis标记肽的单链抗体的方法简单、纯度高 ,以大肠杆菌表达抗乙酰胆碱受体单链抗体时产量低 .