大肠杆菌整体代谢网络调控基因(csrA)的敲除及其对苯丙氨酸生物合成的影响

csrA基因产物是大肠杆菌芳香族氨基酸生物合成途径中碳中心代谢有关的一种全局性调控蛋白质。采用Red敲除系统介导的同源重组的方法定位缺失大肠杆菌染色体csrA基因,经PCR、DNA测序等多种方法证实了基因重组缺失的可靠性。csrA基因缺失后,缺失菌株较对照菌株,糖酸转化率有所提高,发酵生产苯丙氨酸的能力也得到一定的提高,产酸提高约13%。

苯丙氨酸生物合成的整体代谢网络调控基因的敲除

csrA基因产物是大肠杆菌芳香族氨基酸生物合成途径中碳中心代谢有关的一种全局性调控蛋白质。采用Red敲除系统介导的同源重组的方法定位缺失大肠杆菌染色体csrA基因,经PCR、DNA测序等多种方法证实了基因剔除的可靠性。csrA基因剔除后,大肠杆菌芳香族氨基酸生物合成中受csrA表达产物负调控的关键酶的酶活力有所提高,而正调控的关键酶基因活性降低,突变菌株发酵生产苯丙氨酸的能力提高近13%。

L-异亮氨酸产生菌黄色短杆菌的选育

以黄色短杆菌BF420为出发菌株,经过紫外线和亚硝基胍(NTG)复合诱变处理后,获得一株甲硫氨酸缺陷(Met-)及抗α-氨基丁酸(α-AB)的L-异亮氨酸产生菌BM2610,该菌株在未进行优化的发酵条件下能够积累L-异亮氨酸的量为7.12g.L-1,比出发菌株BF420提高了122.5%。

茶叶副产品价值的再利用与开发

实现节能环保已成为世界经济发展的趋势。将茶叶加工中副产品的价值充分发掘出来可以促进茶产业健康持续的发展。如今,茶叶保健功能越来越得到重视,原来茶叶的各种副产物因为多种保健成分的发现也使之成为茶产业发展的新亮点,在生物制药和保健食品等领域必将有广泛的应用。

L-亮氨酸产生菌的代谢工程改造及其发酵效率

以选育的获得产L-亮氨酸的谷氨酸棒杆菌MD106为出发菌株,通过重叠延伸PCR及自杀载体介导的同源重组技术构建panBC及alaT双基因缺失的突变株MD106ΔpanBC/ΔalaT,并对出发菌及双缺失重组菌进行摇瓶发酵试验,测定发酵指数。结果显示,发酵40h后,突变株的L-亮氨酸的产量为7.91g/L,比出发菌株提高43.3%,而且主要杂酸——丙氨酸减少超过80%,总杂酸比例较出发菌株减少55.6%。

黄色短杆菌ilvN基因定点突变和ilvBN、ilvC串联表达对L-缬氨酸产量的影响

由ilv BN、ilv C基因编码的乙酰羟酸合成酶(AHAS)和乙酰羟酸异构还原酶(AHAIR)是L-缬氨酸合成途径的两个关键酶。本实验以黄色短杆菌Brevibacterium flavum MD515为出发菌株,通过PCR技术扩增其ilv BN和ilv C基因,对调节亚基ilv N进行定点突变,获得抗反馈抑制突变型编码基因ilv BNrC;然后将其插入穿梭表达载体p Z8-1中,构建串联表达质粒p Z8-1-ilv BNrC并转化出发菌株,筛选获得工程菌株B.flavum MD515/p Z8-1-ilv BNrC。摇瓶发酵该工程菌株L-缬氨酸产量达29.5 g·L-1,较出发菌株提高27.7%,同时生长速度和生物量也比出发菌株有所提高,丙氨酸含量降低,L-亮氨酸及L-异亮氨酸含量提高。在30 L发酵罐连续补料发酵60 h后L-缬氨酸产量达61.7 g·L-1,糖酸转化率为39.2%。菌株MD515/p Z8-1-ilv BNrC发酵液透光率较出发菌株高且蛋白含量低,这些特性有利于发酵液后期的分离提取。

支链氨基酸合成调控机制及菌种选育策略研究进展

提高国内支链氨基酸产生菌的高产菌株选育水平有助于缩短与国外生产之间的差距,满足国内市场需求。根据支链氨基酸生物合成途径及代谢调节,重点阐述了合成过程中关键酶的代谢调控,介绍了诱变育种、代谢工程、基因组改组及全局转录机器工程四种育种策略的研究进展。在支链氨基酸选育方面,全局转录机器工程育种目前虽无成功实例,但具有很大的潜力,而其他育种策略在氨基酸的选育中均发挥重要作用,可供国内相关育种工作者参考使用。

L-异亮氨酸产生菌的选育

以黄色短杆菌BF420为出发菌株,经紫外线和亚硝基胍复合诱变处理后,单菌落分离筛选到一株营养缺陷型突变菌株BF35(Lys-)。进一步采用氨基酸结构类似物S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸(AEC)、α-氨基丁酸(α-AB)进行抗性筛选,获得一株带有遗传标记的L-异亮氨酸高产突变株BF3510(Lys-+AECr+α-ABr)。该菌株在培养基未优化的条件下摇瓶产酸量为6.4g·L-1,比出发菌株增加了83%。

氧载体、表面活性剂及H_2O_2对L-phe发酵影响的研究

用添加氧载体(油酸、豆油)、表面活性剂(Triton-X100)及H2O2的方法,改善L-苯丙氨酸发酵体系中的氧传递速率,以提高苯丙氨酸的产量。实验结果表明,在发酵0h添加1%的豆油、3%的油酸均可使产酸提高,分别可以使L-phe产量提高21.1%和39.5%;发酵0h同时加入3%油酸和0.05%Triton-X100时,提高产量78.95%;发酵12h添加0.075%H2O2,可以提高产苯丙氨酸产量18.42%。

VHb在产L-苯丙氨酸工程菌中的表达及其抗贫氧效率

人工设计合成密码子优化的VHb基因及其天然的低氧启动子序列,并进行融合T7终止子克隆至L-Phe的高表达质粒中,构建高产L-phe的抗贫氧高密度发酵基因工程菌。高密度发酵过程中的低氧情况可诱导VHb基因的表达,含VHb的工程菌较对照工程菌发酵结果显示:菌株的稳定期延长约4h,提高菌株的产酸周期,L-phe产量提高约14%。

我国小品种氨基酸研究与生产取得重大突破

在我国生物发酵产业中，氨基酸生产占重要地位，L-谷氨酸、L-赖氨酸及L-精氨酸等大宗氨基酸产品的生产规模及生产水平已达到世界先进水平，而小品种氨基酸诸如：L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸及L-异亮氨酸等无论在生产规模还是在生产水平上，均与国外有较大的差距。近年来，福建省麦丹生物集团有限公司及其福州研究院在中国生物发酵产业协会石维忱理事长的关心和指导下，在国家发展与改革委员会的立项资助下，

新型射流内循环搅拌发酵罐的研制

溶氧已成为一些好氧发酵过程的限制因素,目前国家提倡节能减排,一个即节能又能提高溶氧速率的新型发酵罐应有良好的推广前景。本文重点介绍了新型射流内循环搅拌发酵罐的理论依据、布局及中试结果。

L-苯丙氨酸基因工程菌的分子育种研究进展

目前工业发酵生产L-苯丙氨酸的菌株均是由大肠杆菌产生的,随着近年来L-苯丙氨酸市场需求量的增长,使得快速选育高产量遗传稳定性强的新型基因工程菌显得尤其重要。随着基因工程技术和分子生物学手段的不断发展,以及对微生物芳香族氨基酸代谢途径的进一步了解,L-苯丙氨酸生产菌株的选育已经由原来的随机诱变筛选进入到分子育种阶段。本文综述了L-苯丙氨酸基因工程菌的分子育种研究进展。

L-异亮氨酸生产菌发酵水平提高的研究

异亮氨酸在当今社会的应用越来越广泛,福建省麦丹生物集团有限公司福州研究中心对异亮氨酸的生产研究已有十多年的时间,在异亮氨酸生产菌株基础上进行研究,对于提高异亮氨酸的大罐生产水平具有一定的指导意义。

提高L-缬氨酸发酵生产水平的几种方法

目前,国内L-缬氨酸工业化生产还存在着许多问题,例如:产酸率低、杂酸比例高、易染菌等,这与日本等国的生产水平还有较大差距。本文归纳了国内缬氨酸产业化过程采取的一些方法,对于L-缬氨酸大规模工业化生产具有一定的参考意义。

产红霉素基因工程菌MF0015的构建与应用

选用pSET152表达载体进行分子操作,将糖多孢菌的强启动子ermE*连入表达载体,并将红霉素代谢途径上的关键酶基因eryBII、eryF进行串联表达,成功构建pSET152-ermE*-eryBII-eryF表达载体。将构建的表达载体导入红色糖多孢菌FS006中,获得重组菌MF0015,筛选获得的重组菌MF0015及原始菌株FS006进行二级摇瓶发酵验证。结果表明,MF0015发酵液的红霉素效价为7 800U.mL-1,而对照液的FS006红霉素效价为5 400U.mL-1,其效价提高近44%。利用管碟法进行发酵液和对照液的抑菌实验,MF0015发酵液抑菌圈约为2.2cm,对照液FS006抑菌圈约为1.47cm,抑菌效果明显提高。

新型超声波射流微真空脱氮技术在发酵工业废水处理中的应用

采用超声波并结合曝气对高浓度有机废水进行脱氮处理,结果表明,超声波加曝气对高浓度有机废水有良好的脱氮效果。选用功率600W的超声波,适当的曝气量,经过1个小时的运行,初氨氮的去除率达80%以上。

基因敲除策略在氨基酸产生菌代谢工程中的应用

基因敲除技术是一项重要的分子生物学技术,在工业微生物代谢工程中具有广泛应用。从基因敲除技术的一般程序出发,主要介绍了工业微生物常用的基因敲除系统,重点总结了基因敲除策略在微生物代谢工程中的应用,展望了代谢工程的发展前沿和应用前景。

酶法水解L-苯丙氨酸菌体蛋白工艺探讨

L-苯丙氨酸菌体蛋白含量高,采用酸性蛋白酶酶法水解,在pH为3.5,水解时间3h,水解温度40℃,酸性蛋白酶的添加量为2.5%(酶与底物的比值)条件下,菌体氨氮含量提高了两倍。

大肠杆菌ptsG基因的敲除及其对L-phe生产的影响

L-phe是重要的食品和医药中间体,用大肠杆菌发酵葡萄糖生成phe时,对葡糖糖转运起重要作用的磷酸烯醇丙酮酸糖磷酸转移酶系统(PTS)对phe产量合成有很大影响,在大肠杆菌PTS系统中,葡糖糖主要由ptsG基因编码的葡萄糖特异性转运蛋白酶ⅡCBGlc转运入细胞,通过基因敲除技术获取ptsG缺陷菌株,可以减少菌株对葡糖糖的摄取,减少乙酸的生成,利于菌株的高密度发酵和相关代谢中间物获得。利用Red同源重组技术将大肠杆菌染色体上的ptsG基因进行敲除,得到PTS缺陷菌株MD-ptsG-。该菌株在以葡萄糖为惟一碳源的培养基中摇瓶培养,菌密度为对照菌株的3.5倍,L-phe产量提高12%。