海洋微生物酯酶高产菌株的诱变选育研究

以筛选自海洋的产酯酶Bacillus subtilis var.niger为出发菌株,在原生质体制备与再生的最佳条件下制得原生质体,并通过紫外线对其进行诱变处理,采用透明圈初筛和摇瓶复筛,获得高产稳定菌株EB-2,产酶活力由原来的22.8U/mL提高到了77.6U/mL;同时,实验确定了该菌株原生质体制备与再生的最佳条件为:以pH7.2的0.3mol/L KCl和0.3mol/L蔗糖为稳定剂,菌龄在16h时,用10mg/mL的溶菌酶酶液40℃下酶解30min后,原生质体制备率达到91.7%,再生率达到21.3%。

产酯酶海洋微生物的筛选、鉴定及系统发育分析

通过以三丁酸甘油酯和α-乙酸萘酯为底物,建立了一种快速、准确的酯酶产生菌的筛选方法,并从样品中分离到1株产酯酶活力和稳定性较高的菌株EB-1,对其进行了形态学、生理生化特征鉴定和16S rDNA序列分析。结果表明,该菌株与Bacillus subtilis subsp.subtilis模式菌株的同源性高达99.79%;又根据其产黑色素这一特性,最终将其确定为Bacillus subtilis var.niger,其16S rDNA序列在GenBank的注册号为EU016526。

4-甲酰苯基硼酸对蛋白酶MP的抑制作用及其抑制机制的分子动力学模拟

蛋白酶MP(marine protease)是海洋细菌来源的新型碱性金属蛋白酶,在工业中具有良好的应用前景。本文采用酶动力学方法研究4-甲酰苯基硼酸(4-FPBA)对MP的抑制作用,并结合分子模拟的方法,通过水溶液环境下分子力学-玻尔兹曼泊松表面积(MM-PBSA)和量子力学/分子力学混合方法(QM/MM)对其抑制机制进行了研究。结果表明,4-FPBA对蛋白酶MP的抑制过程属可逆的竞争型抑制,抑制常数Ki为0.57 mmol/L。在4-FPBA与蛋白酶MP的结合过程中,范德瓦尔斯相互作用对于其结合发挥了重要作用。明确了Arg59、Leu151、His190和His196的4个残基为蛋白酶MP中与4-FPBA结合的关键残基。该研究结果将为今后进行蛋白酶MP可逆抑制剂的筛选与设计提供理论基础,以提高其液态稳定性,从而拓宽蛋白酶MP在液体洗涤剂中的高效应用。

海活素对肉仔鸡生长发育的影响

将560只1日龄肉雏鸡随机分成7个处理,每处理8个重复,每重复10只鸡(雌雄各半);在基础日粮中分别添加100、200 mg/kg的海活素,以基础日粮为对照,研究海活素对肉仔鸡生长、免疫器官发育、体液免疫反应和肠道菌群的影响。结果表明:①海活素添加量对体重影响显著(p<0.05),且9日龄添加效果优于21日龄添加;②日粮中添加海活素显著影响胸腺、脾脏和法氏囊发育(p<0.05);③各海活素添加组均能提高新城疫苗抗体水平,且添加海活素显著或极显著影响抗体水平;④日粮中添加海活素能够降低21、35日龄肉鸡肠道大肠杆菌数量;200 mg/kg添加水平能提高肉鸡35日龄肠道乳酸杆菌菌群数量,效果好于抗生素组,差异显著(p<0.05)。研究表明,日粮中添加适量海活素能促进肉仔鸡的生长,增强免疫器官发育和体液免疫功能,并且能调整肠道菌群的数量。

产过氧化氢酶菌株CE-1的筛选与鉴定

经过含H2O2的平板初筛和摇瓶发酵复筛,从保存的水样中筛选到一株过氧化氢酶高产菌株CE-1,其所产过氧化氢酶活性和比活分别为1 356.2 U/mL和3 401 U/mg。菌株CE-1为革兰氏阴性杆状细菌,根据其形态特征、16S rRNA基因序列系统进化树分析和生理生化特性,以及属内不同种间性状差异等因素的综合分析,将菌株CE-1鉴定为气单胞属(Aeromonas)细菌。

产酯酶B1海洋枯草芽孢杆菌C5发酵条件优化

为提高芽孢杆菌C5产酯酶B1的能力,采用响应面法对其发酵条件进行优化.首先通过单因素实验筛选氮源、碳源、接种量、起始发酵pH、装液量、发酵温度和转速这7个因素,当酶活达到最高值时,各单因素的值分别为氮源玉米浆30 mL/L,碳源麦芽糖35 g/L,接种量4%(φ),起始pH 7.0,装液量15 mL,培养温度36℃,转速在实验室现有条件下最高选择220 r/min;再通过Plackett-Burman(PB)设计法,评价了这7个因素对酯酶B1产量影响的大小,确定氮源玉米浆的浓度、发酵起始pH和发酵温度为酯酶产生的3个主要影响因素;利用中心组合设计(CCD)及SAS软件分析获得了主要因素的最优条件,即玉米浆浓度28.70 mL/L,起始发酵pH为7.10,发酵温度为35.8℃.预测最高酶活力为139.18U/mL,实验最终酶活达到138.40 U/mL,与原发酵条件相比提高了228.15%.其实验值与预测值基本相符,说明预测模型可应用于酯酶发酵条件的优化.

海洋低温蛋白酶对肉仔鸡生长发育的影响

选用1日龄ROSS 308健康肉仔鸡,720只公母混合雏随机均分为4组,公母各半,每组设3个重复,每个重复60只,个体初重各组间无差异(P>0.05)。4个组分别添加0、300×10-6、500×10-6、600×10-6的海洋低温蛋白酶,自由采食、饮水饲养至35日龄。结果表明饲养效果以500×10-6最好。以500×10-6海洋低温蛋白酶的添加量,选用1日龄ROSS 308雏鸡640只进行集中育雏,预试7 d,随机均分为对照组、试验组,每组320只,设4个重复,每个重复80只。对照组饲喂原饲料基础日粮,试验组在基础日粮上将前述试验结果较好的500×10-6海洋低温蛋白酶进行添加,其他营养性添加剂、抗氧化剂、酸制剂等完全相同;自由采食、饮水饲养至42日龄,试验35 d。结果表明,能提高肉仔鸡的体重3.53%、饲料转化率2.66%、脾脏指数提高2%,胸腺指数4.8%,法氏囊指数变化不大,机体免疫力与抵抗力显著增强。能适当提高鸡肠道内乳酸杆菌的数量,而相应抑制大肠杆菌的数量,使肠道内菌群平衡,可以作为环保型饲料添加剂。

海洋细菌HW08的鉴定及其所产低温碱性蛋白酶Ps5的分离纯化

由黄海底泥分离得到1株能够稳定高产蛋白酶的菌株,命名为HW08。对该菌株进行形态特征、生理生化分析表明,其为革兰氏阴性杆菌,极生单鞭毛,非发酵型,严格需氧,细胞内不积累多羟基丁酸作为储藏碳源,氧化酶阴性。将该菌16S rDNA序列(GenBank登录号FJ999660)和假单胞菌属中模式菌株16S rDNA序列进行比对,构建系统发育树,将其确定为Pseudomonas lundensis。分离纯化得到该菌分泌的蛋白酶Ps5,SDS-PAGE电泳显示其分子量为46kDa。Ps5的最适作用条件为pH10.4,温度30℃;其活性被EDTA显著抑制,表明Ps5属于金属蛋白酶家族。以AAPF为底物,测定Ps5酶动力学参数,计算表明K_m为1.17 mM,最大反应速率V_(max)为0.32μmol/min。