棘孢木霉与30%霜霉·嘧菌酯协同防治烟草镰刀菌根腐病

为筛选防治烟草镰刀菌根腐病高效、安全的复配剂,采用菌丝生长速率法测定生防棘孢木霉Tr-0111、化学杀菌剂30%霜霉·嘧菌酯对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的毒力及两者的相容性,同时测定两者混配对尖孢镰刀菌的毒力系数,并通过盆栽试验评价其对烟草镰刀菌根腐病的防治效果。结果表明,30%霜霉·嘧菌酯和棘孢木霉Tr-0111对尖孢镰刀菌均具有较强的毒力,其EC50值分别为0.0643 mL/L、2.36×10^(2)cfu/mL,且两者相容性好。除V30%霜霉·嘧菌酯∶V_(Tr-0111)=4∶6时无增效作用,其他8个混配比例均具有增效作用,其中V_(30%霜霉·嘧菌酯)∶V_(Tr-0111)=7∶3时增效比率最高,为1.16,抑菌率为68.37%。盆栽试验结果表明,V_(30%霜霉·嘧菌酯)∶V_(Tr-0111)=5∶5时,对烟草镰刀菌根腐病的防效最好,为78.18%,其次为7∶3和1∶9,防效分别为77.27%和72.73%,均显著高于单一使用30%霜霉·嘧菌酯和棘孢木霉Tr-0111。因此,可以将0.0643 mL/L 30%霜霉·嘧菌酯和2.36×10^(2)cfu/mL棘孢木霉Tr-0111以5∶5比例混匀复配应用于烟田防治烟草镰刀菌根腐病,减少化学农药使用。

烟草镰刀菌根腐病生防假单胞菌的筛选与鉴定

【背景和目的】镰刀菌引起的根腐病是烟草主要土传病害之一,为筛选对烟草镰刀菌根腐病菌具有较好抑制作用的假单胞菌。【方法】采用稀释涂布平板法从健康烟株根际土壤中分离纯化对烟草镰刀菌根腐病(Fusarium root rot)主要病原具有一定拮抗作用的假单胞菌;采用形态学、生理生化特征和16S rDNA序列分析鉴定,并测定促生防病效果。【结果】(1)分离纯化的2株假单胞菌分别为铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa YZ66和绿针假单胞菌P.chlororaphis YX33;(2)YZ66和YX33对茄病镰刀菌(F.solani)菌丝的抑制效率分别为79.66%和76.68%,对尖孢镰刀菌(F.oxysporum)的抑制效率分别为79.93%和57.48%,对烟草疫霉菌(Phytophthora nicotianae)、根串珠霉菌(Thielaviopsis basicola)等也有抑制效果;(3)2株菌株具有显著的促生防病作用,YZ66盆栽防病效果在81.21%以上,YX33在67.55%以上;最大叶面积、鲜重等有所增加;(4)2菌株均含吩嗪-1-羧酸(Phenazine-1-carboxylic acid,PCA)合成基因,发酵液对病原孢子萌发抑制率84.92%~93.24%,挥发性化合物可抑制病原菌丝生长或产孢。【结论】2株生防假单胞菌具有较好的促生防病效果,应用前景良好。

烟草镰刀菌根腐病抗性鉴定方法研究

为获得不同烟草品种镰刀菌根腐病抗性的鉴定方法,采用镰刀菌粗毒素幼芽接种、孢子悬浮液培养、带菌菌谷接种、离体叶片菌饼接种、草酸局部注射等5种方法对4个品种(小黄金1025、中烟100、长脖黄、664-01)的镰刀菌抗病性进行了研究。结果表明,镰刀菌毒素液胁迫法可以鉴定品种的抗感程度,适宜体系毒素浓度为8%,处理时间6 d;镰刀菌孢子悬浮液接种法可以鉴定品种的抗感程度,适宜体系孢子液浓度为107个/mL,处理时间4 d;带菌菌谷接种也可以鉴定品种的抗感程度,适宜体系菌谷比例为20%,处理时间9 d;离体叶片用菌饼和草酸液处理,能区分品种的抗感性,但不能区分品种的抗感程度。研究结果认为孢子悬浮液接种法和带菌菌谷接种与其他3种方法相比可以准确评价品种对镰刀菌根腐病的抗感性。

豫南烟区烟草青枯病菌拮抗内生细菌的筛选及其防病效果初探

为了获得烟草青枯病菌的稳定拮抗内生细菌菌株,从豫南烟区烟草栽培品种中烟100和云烟87的根茎中共分离到208株细菌,利用平板共培养法筛选出9株对烟草青枯病菌具有拮抗效果的菌株。其中菌株Rsa3对烟草青枯病菌的抑菌效果最好,抑菌圈半径达7 mm,且在转移5~6代后仍具有较强的抑制效果。依据16S r DNA序列,将拮抗菌Rsa3鉴定为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。该细菌发酵液对烟草青枯病菌有明显的抑制作用,其作用主要在于菌体本身,在温室盆栽试验中发酵液的防病效果可达79.17%,同时具有促进烟苗根系生长的能力。以上结果表明,拮抗菌Rsa3对烟草青枯病具有较好的抑菌和防病作用,同时对烟苗的根系有明显的促生长效果,具有潜在的应用价值。

烟草花叶病毒实时荧光定量PCR检测体系的构建

[目的]防止隐症携带烟草花叶病毒(TMV)的烟苗移栽到大田造成产量损失。[方法]根据TMV的外壳蛋白(coat protein,CP)基因保守序列设计引物及探针,通过绘制标准曲线、重复性、特异性及灵敏性分析,建立了一种TMV的TaqMan-qPCR检测方法。[结果]该方法特异性好,与其他常见的烟草病毒无交叉反应;灵敏度高,检测下限可达到4.53×10^(1) copies/μL,比常规RT-PCR检测灵敏度提高了10倍;建立的标准曲线斜率为-3.299,决定系数(R^(2))为0.9933,扩增效率为100.97%,且循环阈值(Ct)与质粒标准品浓度之间线性关系良好,重复性试验结果可靠。[结论]利用建立的TaqMan-qPCR检测方法与常规RT-PCR检测方法同时检测烟苗样品,检测结果一致,进一步验证了荧光定量PCR方法的可靠性。

烟草种质资源常规化学成分分析及聚类评价

为烟草种质资源的创新利用,选取38个烟草种质资源进行田间试验,分析比较其常规化学成分并进行相关和聚类分析。结果显示,钾、氯、糖碱比和钾氯比变异系数较大,而总糖、还原糖、总氮和氮碱比变异系数相对较小。38个烟草种质聚为三类,第1类各主要化学成分含量中等适宜、协调性好;第2类总氮、氯含量适宜,烟碱高,总糖、还原糖、钾含量低;第3类总氮、烟碱和氯含量适宜,总糖、还原糖、钾含量稍低。从38个烟草种质中筛选出高烟碱种质8个,含钾量高的种质1个,钾氯比大的种质18个。

不同基因型烤烟对镰刀菌根腐病的抗性鉴定与评价

为明确不同基因型烤烟对烟草镰刀菌根腐病的抗性,利用10个烟草品种(系),采用粗毒素幼芽接种、带菌菌谷接种、孢子悬浮液培养等方法进行抗性鉴定。结果表明,供试品种对尖孢镰刀菌抗性表现出显著差异;对尖孢镰刀菌表现出抗的品种(系)有4个,分别是‘Y2001’、‘Y2002’、‘长脖黄’、‘664-01’;对尖孢镰刀菌表现出感的品种(系)有6个,分别是‘7710’‘、7713’‘、Y2007’‘、Y2008’‘、中烟100’、‘小黄金1025’。3种接种方法鉴定结果基本一致,共筛选出4个抗性品种(系)。

河南烟区烟草病毒病种类与分布

为明确近年来河南省烟草病毒病的种类及分布状况,利用9种病毒血清通过酶联免疫吸附法(ELISA)对2015—2017年间河南11个烟叶产区的566份病毒病样品进行了系统检测。结果表明,河南烟区病毒病总检出率为96.47%;烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)、烟草蚀纹病毒(Tobacco etch virus, TEV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)和烟草脉带花叶病毒(Tobacco vein banding mosaic virus, TVBMV)5种病毒在河南烟区危害最为严重,且TMV已发展为河南烟区病毒的优势种。全省侵染类型中单一病毒侵染率为34.63%,TMV的单一病毒侵染率最高,为26.86%;两种及以上病毒复合侵染率为61.84%,复合侵染主要存在5种类型,即TMV+CMV、TMV+CMV+TEV、TMV+TEV+PVY、TMV+TEV+TVBMV、TMV+CMV+TEV+PVY,侵染率分别为18.73%、3.36%、3.89%、5.83%和7.24%。因此,河南省11个烟叶产区的主要病毒种类确定为TMV、CMV、TEV、PVY和TVBMV,侵染类型为TMV+CMV、TMV+CMV+TEV、TMV+TEV+PVY,TMV+TEV+TVBMV、TMV+CMV+TEV+PVY。

基于非靶向代谢组学的烟草镰刀菌根腐病和黑胫病拮抗链霉菌及其代谢产物的鉴定

针对烟草两种土传病害病原菌—镰刀根腐病菌Fusarium oxysporum和黑胫病菌Phytophthora parasitica,本实验室前期从烟草根际土壤中筛选得到1株具有良好生防作用的链霉菌,结合形态学、生理生化特性及分子生物学分析,将其鉴定为淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochromogenes。通过对该生防菌发酵液进行色谱-质谱联用(LC/MS)非靶向代谢组学分析,确定其重要代谢产物为茴香霉素。利用高效液相色谱对产物进行验证及含量测定,表明每克粗提物中含有茴香霉素423.98μg。菌丝生长抑制试验结果表明,茴香霉素对镰刀根腐病菌和黑胫病菌的EC_(50)值分别为1556.36和40.74μg/m L。本研究为烟草镰刀菌根腐病和黑胫病的生物防治提供了新的方法,并为其代谢产物—茴香霉素的进一步利用提供了有价值的理论基础。

3种拮抗烟草疫霉及产IAA内生细菌的分离鉴定

为挖掘河南省洛阳地区烟株体内的内生细菌功能菌株,以期开发优良生防菌剂。采用稀释涂布平板法分离纯化烟株各生育时期内生细菌菌株,采用平板对峙法、生长速率法测定内生菌株对烟草疫霉的抑制作用,紫外分光光度计法测定菌株产生IAA的水平。对筛选出的功能内生菌株进行形态学、生理生化鉴定及16S rDNA、gyrB序列分析鉴定,并测定对种子萌发的促生作用。结果表明,筛选出的12株内生菌株的鉴定结果为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7株,沙福芽孢杆菌(B.safensis)4株,奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)1株。芽孢杆菌属占菌株总数的91.67%,其中菌株LYYY63-1、LYRY39-1、LYSX141具有较强的抑制活性,对烟草疫霉的抑菌率分别为88.10%、84.55%和73.33%;沙福芽孢杆菌菌株LYYY61-2、LYYY117对烟草疫霉的抑菌率达62.10%、64.72%;奇异变形杆菌菌株LYRY45产IAA水平达11.06 mg/L,具有较高的产IAA水平。12株细菌对烟草7种病原真菌具有不同程度的抑制作用,抑菌谱广,对烟草种子根长和总长均有显著的促生效果,其中菌株LYRY45的促生效果最为显著,种子萌发率达98.00%,处理组根长增长37.76%,茎长增长21.43%,总长增长33.96%。研究分离鉴定了洛阳地区健康烟株中3类具有抑菌、促生效能的内生细菌菌株,希望为生防菌防治烟草病害提供理论基础。

河南烟草镰刀菌的分子鉴定及致病性分析

为明确河南省不同烟叶产区危害烟草的镰刀菌种类,以河南省烟叶产区典型镰刀菌根腐病烟株及烟田土壤为供试样品,采用组织分离法和土壤分离法获得纯化菌株,根据菌株形态和r DNA-ITS序列分析对病原菌进行鉴定,并采用无创接种法测定病原菌对烟草的致病性。结果表明,获得的98个菌株在PDA培养基上均产生白色菌丝,大型分生孢子呈镰刀形或马特形,无色、多孢;小型分生孢子呈肾形、椭圆形或卵形,无色、多无分隔。序列比对结果显示,所分离的98株菌分属尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、茄病镰刀菌(Fusarium solani)、层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)、木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)和Fusarium nematophilum。致病性分析结果表明,尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、层出镰刀菌和木贼镰刀菌对烟苗具有致病性;48株致病菌中豫南烟区烟草镰刀菌根腐病致病性病原菌为尖孢镰刀菌、层出镰刀菌和木贼镰刀菌,以尖孢镰刀菌为主;豫中为尖孢镰刀菌;豫东、豫西为茄病镰刀菌和尖孢镰刀菌。因此,尖孢镰刀菌为全省烟区重点防控对象,豫南烟区还需加强层出镰刀菌和木贼镰刀菌的防控,豫东、豫西需防范茄病镰刀菌的发生。

烟草疫霉菌拮抗细菌的筛选鉴定及发酵条件优化

为了筛选对烟草疫霉菌具有拮抗作用的生防细菌菌株,本研究从烟草黑胫病病圃地采集健康烟株的根际土样,采用对峙培养法筛选得到8株对烟草黑胫病具有拮抗作用的细菌菌株,其中编号为LB-9的菌株对烟草疫霉菌的抑制作用最强且效果稳定,抑菌率为60.6%,且抑菌谱广,对其进行16S rRNA基因序列分析后将该菌株鉴定为多粘芽孢杆菌。采用单因素优化试验初步探究了多粘芽孢杆菌LB-9的最适发酵条件,明确了LB-9的最适发酵培养基、最适发酵温度、最适发酵时间和最适发酵初始pH值,对其生防制剂的开发应用具有重要意义。

拮抗烟草疫霉菌的木霉菌株筛选鉴定及防病促生作用研究

为了获得对烟草黑胫病菌具有较好拮抗效果的木霉菌株,从河南省各烟区烟草根茎类病害发生较重烟田健康烟株的根际土壤中共分离获得疑似木霉菌28株,通过平板对峙培养,筛选出菌株XYPQ-1、ZMD-1和XYLS-5对烟草疫霉菌具有较强抑制作用,5 d后抑菌率达90%以上。利用分子生物学方法分别将其鉴定为绿木霉菌(Trichoderma virens)、拟康宁木霉菌(Trichoderma koningiopsis)和近渐绿木霉菌(Trichoderma paraviridescens)。对其代谢物抑菌活性及防病促生效果进行了初步研究,结果表明,3种木霉菌产生的挥发性和非挥发性代谢物均对疫霉菌具有明显的抑制作用,其中XYLS-5的抑制效果最好,处理后5 d,其挥发性和非挥发性代谢产物的抑菌率分别达61.71%和100.00%。3种木霉菌对烟草黑胫病均具有较好的室内防效,其中XYLS-5的防效最高,达80%以上,且具有促进烟草种子萌发和根系生长的作用,可作为烟草黑胫病生物防治的拮抗菌加以开发应用。

烟草品种对镰刀菌根腐病的抗性鉴定

采用盆栽烟株带菌麦粒接种法测定12个烟草品种(系)对烟草镰刀菌根腐病的苗期抗病性,结果表明,中烟98、贵烟6号、云烟87、7478、NC89和豫烟13号对镰刀菌具有较高抗性,KRK26、中烟100和中烟205中等抗病,小黄金1025、豫烟10号和长脖黄对镰刀菌易感,在所有测试样品中,长脖黄抗性最低。长脖黄、小黄金1025和豫烟10号可作为对镰刀菌根腐病检测预警材料及镰刀菌根腐病的感病对照样品应用于相关研究中。

不同烟草品种上烟蚜的繁殖特征分析

为了明确河南省烟田烟蚜[Myzus persicae(Sulzer)]生长繁殖的最适烟草寄主,分析了不同烟草品种个体发育及烟蚜在不同烟草品种上的生长发育历期、存活率和繁殖力等,获得了净增殖率、周限增长率、内禀增长率、平均世代周期、种群加倍时间等生命表参数,并比较了不同烟草品种上烟蚜的扩繁量和平均产仔量。结果显示,18个烟草品种中许金4号、长脖黄2248、竖把2129、螺丝头2474、大柳叶2013、大白筋599和NC89的成苗时间最短,约46 d,庆胜2号和革新1号成苗时间最长,约60 d;若蚜历期在长脖黄2248上最长(7.91 d),大竖把2141上最短(5.91 d);成虫生殖期在革新3号、中烟100、Y106、大柳叶2012和竖把2129上均大于12.00 d;世代历期在革新3号上最长(24.60 d),大白筋599上最短(12.42 d),大白筋2505、长脖黄2248、革新1号、竖把2129、螺丝头2474和大柳叶2013上接近平均值,均为20 d左右;单头烟蚜总产仔量为庆胜2号>螺丝头2474>中烟100>竖把2129>竖把2135,且均>40头,其他烟草品种上单头烟蚜总平均产仔量均小于40头;大柳叶2012、大竖把2141、庆胜2号、竖把2129、螺丝头2474、竖把2135及中烟100内禀增长率rm高于其他供试烟草品种,表明相同条件下烟蚜偏好取食大柳叶2012、大竖把2141、庆胜2号、竖把2129、竖把2135、螺丝头2474和中烟100烟草品种;但大柳叶2012、大竖把2141、庆胜2号和竖把2135上烟蚜的繁殖量较少。可见,在18个供试烟草品种中,烟草竖把2129和螺丝头2474最适于烟蚜的扩繁。

鸢尾丝囊霉(Aphanomyces iridis)引起的烟草漂浮苗根腐病的初步报道

为明确近年来烟草漂浮育苗过程中出现的疑似根腐病的病原,2017年5月分别从河南省宝丰、泌阳、许昌、临颍等烟区苗床共采集12个具有代表性的病害样本,进行病原菌分离、形态学鉴定、18S rDNA-ITS序列分析和致病性测定。结果表明,从样本中分离纯化出10个真菌菌株,其18S rDNA-ITS序列与NCBI数据库中鸢尾丝囊霉(Aphanomyces iridis)序列同源性均为99%。漂浮苗及盆栽接种试验结果表明,烟苗接种后均有不同程度的发病,发病率为100%。将发病组织在PDA培养基上进行分离培养,也同样得到丝囊霉菌。本研究根据发病症状和病原菌,首次明确了鸢尾丝囊霉可引起烟草漂浮苗根腐病。

基于RAPD分子标记的烟草青枯病菌特异引物筛选及效果评价

为建立烟田土壤和烟株烟草青枯病菌的快速诊断方法,本研究采用RAPD方法筛选获得了6对可用于烟草青枯病菌PCR检测的特异性引物。经对6种细菌(烟草青枯病菌、多粘芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、节杆菌、荧光假单胞菌、野火病菌)和2个烟草品种(中烟100和云烟87)的检测验证,6对引物均具有良好的灵敏度、特异性和可靠性。对青枯菌菌液DNA的检测灵敏度可达0.42 pg/μL,对土壤青枯菌的最低检出率为6×10^(2) cfu/g。应用特异引物A1T和S13T可对接种土壤和烟株样品的研磨悬浮液直接进行PCR快速检测,显著地缩短了检测时间,对烟叶产区烟草青枯病的预测预报及防控具有重要意义。

EMS诱变不同香韵类型烟草突变体的初步筛选

为了获得不同香韵类型的烟草新品系,以中烟100 EMS诱变处理的后代为材料,在腺毛密度筛选的基础上,对比分析初选后代腺毛密度、叶面分泌物含量、中性香气物质含量等相关指标,结果表明:与CK(中烟100)相比,MC-29、SX-19、MC-67等8份材料腺毛密度极显著增加,SX-3、SX-3A、MC-67等3份材料叶面分泌物含量增加100%以上。通过分析各突变株系中性香气物质含量与香韵类型的关系,最终筛选出MC-29、SX-17、SX-19等3个香气物质含量较高的株系,MC-29、SX-17、SX-19等3个具有清香气息的株系,MC-67、SX-3A等2个具有青草香韵的株系,MC-70、SX-18、SX-8、SX-17等4个具有类似花香香韵的株系,SX-14、MC-1等2个具有紫罗兰香韵株系,可以作为不同香韵类型的突变材料。

烟草长柄分泌型腺毛的遗传分析

烟草长柄分泌型腺毛的分泌物对烟叶的品质有重要影响,为了明确长柄腺毛的遗传特性,以纯合长柄分泌型腺毛烟草材料T.I.1068为父本、非分泌型腺毛烟草材料T.I.1112为母本,构建6个世代的群体(P1、P2、F1、F2、BC1、BC2),利用主基因+多基因混合遗传模型分离分析方法,研究烟草长柄分泌型和非分泌型腺毛的遗传规律。结果表明,烟草长柄分泌型腺毛与非分泌型腺毛相对比例的遗传由2对加性-显性-上位性主基因+加性-显性上位性多基因模型控制。BC1、BC2和F2世代主基因的遗传率分别为80.05%、97.88%和96.50%,主基因遗传率很高,可以在早代进行腺毛种类的选择;BC1、BC2和F2世代多基因的遗传率分别为16.15%、1.55%和2.75%,BC1代应考虑多基因的影响,BC2和F2代多基因的影响较小。可见,长柄分泌型与非分泌型腺毛相对比例的遗传受2对主基因控制,以主基因效应为主,受基因间的互作的影响。

烟草镰刀菌根腐病拮抗细菌的筛选鉴定及促生防病效果

为挖掘对烟草镰刀菌根腐病具有较强拮抗作用的生防菌株,采用稀释涂布平板法从健康烟株根际土壤中分离纯化对烟草镰刀菌根腐病(Fusarium root rot)主要病原具有一定拮抗作用的细菌,进行形态学、生理生化特征和16S rDNA序列分析鉴定,并测定促生防病效果。经平板对峙测定,筛选出2株对烟草镰刀菌根腐病病原具有较好抑制作用的菌株YX53和YX72,对茄病镰刀菌(F.solani)的抑制效率分别为83.66%和73.54%,对尖孢镰刀菌(F.oxysporum)的抑制效率分别为57.57%和55.89%;2菌株无菌发酵滤液对病原孢子萌发抑制率为84.82%~100%,其挥发性化合物可抑制病原菌丝生长或产孢,且对烟草疫霉菌(Phytophthora nicotianae)、根串珠霉菌(Thielaviopsis basicola)等也有抑制效果。鉴定结果表明,YZ53和YX72分别为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus和枯草芽孢杆菌B. subtilis。经2菌株处理的烟苗胚根增长率分别达到了67.86%和161.61%,盆栽烟苗根长、最大叶面积、鲜质量等均有所增加;YX53盆栽防病效果在89.47%以上,YX72在99.53%以上。